类器官-免疫细胞共培养全实操：从PBMC分离到效靶比优化，一步不漏

类器官与免疫细胞共培养常用于肿瘤免疫、免疫治疗药效和免疫毒性研究。PBMC状态、免疫细胞组成、类器官大小、培养基兼容性和效靶比都会影响最终杀伤结果。

如果研究肿瘤特异性T细胞反应，优先使用患者来源肿瘤类器官与自体PBMC/T细胞。异体PBMC虽然更容易获得，但HLA不匹配本身就可能引起明显的异体免疫反应，结果不能直接解释为肿瘤特异性杀伤。

使用EDTA或肝素抗凝全血，将全血与PBS按约1:1稀释后，缓慢铺到Ficoll上层，操作过程中保持血液与Ficoll界面清晰。常用条件为400 ×g、30～40 min、室温、关闭刹车。离心后从上到下依次为血浆、PBMC白膜层、Ficoll以及红细胞/粒细胞层。

吸取PBMC层后加入PBS或PBS+2% FBS洗涤，可采用约300 ×g、5～10 min收集细胞。随后计数并检测活率，在细胞团聚明显时先排查血样放置时间、死细胞释放DNA以及洗涤是否充分。

图1丨Ficoll 密度梯度离心分层图

PBMC中同时包含T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，适合观察整体外周免疫细胞反应。

T细胞功能实验常在共培养前使用anti-CD3/CD28结合IL-2进行短期激活或扩增。不同研究目的下激活强度不同：

如果筛选和扩增肿瘤反应性T细胞，可以进行较长时间的类器官重复刺激；

如果只是比较已有T细胞的杀伤能力，则应减少过强的非特异性预激活。

肿瘤类器官还可使用IFN-γ预处理，提高MHC-I和抗原呈递水平，但这会同时改变PD-L1等分子表达，因此所有组的处理条件必须一致。

共培养前选择生长状态稳定、边界完整的类器官，去除明显死亡和腔内碎屑较多的结构。过大的类器官会造成免疫细胞进入困难，组内大小差异也会直接影响杀伤结果。

根据实验目的可保留小类器官片段，也可以解离成单细胞后重新进行短期杀伤实验。研究三维浸润时应保留3D结构；研究T细胞识别和杀伤效率时，将成熟类器官机械处理成大小相近的小片段通常更容易控制。

基质也会影响免疫细胞接触靶细胞。高浓度BME/Matrigel dome能够维持完整3D形态，但免疫细胞进入速度较慢；降低基质比例或使用悬浮共培养，可以增加免疫细胞与类器官直接接触。

图2丨类器官 - 免疫细胞共培养三大模式示意图

E中的E是效应细胞数量，T是靶细胞数量。如果使用PBMC，E代表PBMC总数；如果使用纯化CD8+ T细胞或NK细胞，则按实际效应细胞数量计算。

3D类器官不能直接用“1个类器官=1个靶细胞”计算。可以从同批类器官中取一部分完全解离成单细胞并计数，用得到的平均细胞数估算正式共培养孔中的靶细胞数量。即先将一孔类器官消化成单细胞计数，再确定E。

不同体系使用的比例差异很大，在正式实验前可先设置1:1、5:1、10:1、20:1等梯度，选择既能看到明确杀伤差异、又不会在短时间内把类器官全部杀死的范围作为后续条件。

图3丨梯度效靶比杀伤率对比图

将类器官片段按统一数量或细胞当量接种，再加入相应数量的免疫细胞。培养基需要同时维持类器官和免疫细胞状态，可以使用经过验证的T细胞培养基、调整后的类器官培养基，或二者按一定比例混合。已有PDO-PBMC体系采用50% RPMI与50%类器官基础培养基进行共培养。

短期杀伤实验常观察24～72 h，需要T细胞扩增或反复刺激时则可能延长至1～2周。时间越长，培养基组成、免疫细胞增殖和类器官自身生长造成的干扰越明显，因此杀伤实验和T细胞扩增实验要分开设计。

类器官端可以使用Live/Dead染色、Caspase活性、活体成像或流式进行评价。流式时可将类器官消化成单细胞，通过EpCAM等肿瘤/上皮标志物结合活死染料统计剩余活靶细胞。成熟的类器官-T细胞杀伤方案也常通过活肿瘤细胞绝对计数而不是只看培养液中的LDH判断杀伤。

免疫细胞端可检测CD107a、IFN-γ、TNF-α、Granzyme B、CD137等指标，其中CD107a反映脱颗粒，IFN-γ和CD137可用于评价T细胞对肿瘤的反应。

基础对照至少包括类器官单独培养、免疫细胞单独培养和共培养组。如果研究肿瘤特异性，可增加配对正常组织类器官或MHC-I阻断组，区分真正的肿瘤特异性杀伤与非特异性细胞毒性。

图4丨类器官 Calcein-AM/PI 活死染色结果图

1. 类器官几乎全部死亡：

先降低E比，检查类器官本身状态和培养基是否兼容，同时确认免疫细胞是否经过度激活。

2. PBMC很多，但杀伤很弱：

PBMC总数不等于有效杀伤细胞数，应进一步看CD8+ T细胞、NK细胞比例和活化状态，同时检查类器官MHC-I或靶抗原表达。

3. 不同孔结果波动很大：

重点检查类器官大小、每孔靶细胞量、PBMC沉降和基质分布是否一致。

4. 免疫细胞都停在胶滴外：

基质浓度过高或类器官包埋位置过深时，短时间共培养难以形成充分接触，可降低基质比例或改用悬液/低BME体系。

类器官-免疫细胞共培养需要统一免疫细胞来源和状态、类器官大小、靶细胞数量、基质条件、培养基和E比。PBMC适合观察整体免疫反应，纯化T细胞或NK细胞更适合做明确的杀伤机制研究；3D类器官计算效靶比时应按实际细胞当量，而不是直接按类器官个数计算。