气道类器官的培养基关键因子及核心信号通路的机制总结！

气道类器官（AO）是以气道干细胞为来源构建的三维体外上皮模型。

1）2009年Hogan团队首次建立基于成体气道基底干细胞的气道类器官（气管球tracheospheres），可形成带管腔的三维球体，包含基底细胞、搏动纤毛的纤毛细胞，但缺少成熟棒状细胞、杯状细胞等分泌型细胞；分离的单个气管基底细胞接种于Matrigel基质胶，3周即可形成球体结构。

2）后续Tschumperlin团队实现多细胞共培养体系：将原代支气管上皮细胞、肺微血管内皮细胞、肺成纤维细胞按10:7:2共培养，快速形成多细胞管状结构，但培养基偏向上皮细胞，内皮、成纤维细胞会随培养时间快速丢失。该研究同时发现：气道基底细胞具备高度上皮可塑性，可同时向气道谱系、肺泡谱系双向分化。

3）Sachs经典长期扩增体系（里程碑）：通过组合小分子与生长因子鸡尾酒培养基，实现人原代气道上皮细胞长期传代（＞1年）；构建的中空球体完整复刻人假复层气道上皮，包含基底细胞、棒状细胞、杯状细胞、功能性搏动纤毛细胞；后续优化方案可定向富集纤毛细胞，用于纤毛功能障碍疾病研究。该方案成为后续绝大多数气道类器官的基础范式。

气道稳态、损伤修复、体外类器官扩增分化高度依赖TGF‑β/BMP/SMAD、FGF、Wnt/β‑catenin三大信号网络，通路之间存在相互串扰，信号的激活/抑制强度、时序动态变化决定基底干细胞的命运（增殖静息/自我更新/定向分化）。

气道类器官中的核心信号网络

1.TGF‑β/BMP/SMAD信号通路

该通路是决定气道基底细胞静息‑增殖开关的核心通路。

①生理稳态状态：TGF‑β、BMP信号高活性，下游p‑Smad1/5/8、p‑Smad2/3维持较高水平，使基底干细胞维持静息；同时驱动上皮向棒状细胞、纤毛细胞分化，抑制干细胞增殖。

②气道损伤修复状态：上皮细胞损伤后，TGF‑β/BMP信号下调，磷酸化Smad分子水平下降，解除对基底细胞增殖的抑制，启动干细胞增殖，参与损伤区域修复。

③体外类器官培养机制：

添加BMP4、TGF‑β（通路激动剂）：强烈抑制细胞增殖、抑制类器官扩增；

使用Noggin（BMP抑制剂）+A83‑01（TGF‑β受体抑制剂）联合阻断通路：强烈刺激基底细胞增殖，但是会抑制棒状细胞、纤毛细胞分化；二者联用增殖促进效应更强。

④实操要点：扩增阶段需要抑制该通路实现干细胞扩增；分化阶段需要部分恢复TGF‑β/BMP活性，实现上皮细胞分化成熟；因此Noggin、A83‑01是人气道类器官扩增培养基的标准组分。

2.FGF信号通路

FGF通路为肺上皮生存、自我更新的必需通路，缺失FGF直接导致类器官无法形成。

①受体分布：FGFR1分布于基底细胞、分泌细胞、纤毛细胞；FGFR2主要表达于基底细胞、分泌细胞，是干细胞自我更新关键受体。

②FGFR1功能：稳态条件下抑制基底细胞过度增殖，维持上皮静息，损伤修复阶段不起主导作用；

③FGFR2功能：激活后介导基底细胞自我更新，并且分化成为气道成熟管腔细胞；FGF7、FGF10是FGFR2关键配体，优于FGF2、FGF9，显著提升类器官形成效率、增大球体体积。

④体外培养机制：几乎所有肺类器官（正常/肿瘤类器官）培养基均加入FGF7/FGF10；同时FGF通路参与胚胎肺祖细胞干性维持；FGF与Wnt通路存在协同互作，共同维持上皮稳态。

3.Wnt/β‑catenin信号通路

信号剂量（高/中/低）决定基底干细胞细胞命运，是可逆调控模式。

①高Wnt信号：上调并维持ΔN‑Tp63表达，驱动基底细胞大量增殖；抑制向纤毛细胞、棒状细胞分化，适合类器官扩增阶段；

②中等Wnt信号：激活foxj1基因表达，是纤毛细胞发生、纤毛成熟分化的必要条件；

③低Wnt信号：干细胞增殖停止，促进细胞终末分化。

④病理层面：Wnt通路过度激活和基底细胞增生、肺鳞状细胞癌密切相关；高通量筛选得到Wnt小分子抑制剂，可逆转过度增殖，恢复气道上皮稳态。

⑤体外培养工具分子：

WNT3A：与FGF10协同，提升类器官形成率，促进功能细胞分化；

R‑spondin1：广泛用于气道类器官，维持肺祖细胞克隆形成能力，实现长期扩增（借鉴肠道类器官体系）。

⑥通路网络总逻辑：高Wnt+高FGF+抑制TGF‑β/BMP/SMAD→基底细胞增殖、类器官扩增；中等Wnt、部分FGF因子、激活TGF‑β/BMP/SMAD→上皮定向分化成熟。

iPSC来源肺泡类器官需要多阶段分步诱导（定形内胚层→前肠内胚层→肺祖细胞→肺泡类器官）；

AdSC主要来源于原代成人AT2肺泡Ⅱ型上皮细胞，基于气道培养基改良获得肺泡表型。

关键技术要点总结：

iPSC体系是分步时序诱导，不同分化阶段需要切换不同细胞因子组合，周期长，可模拟人肺胚胎发育；缺点：诱导效率低，细胞异质性高；

AdSC体系大多基于Sachs气道培养基改造，CHIR‑99021（Wnt激动剂）是诱导肺泡谱系的核心小分子；可共培养成纤维细胞补充基质微环境信号；

SFFF无血清无饲养层体系（Katsura）排除动物血清未知组分，更适合分子机制研究；人血清因取材限制很少常规使用；

AdSC来源于患者活检微量组织，保留供体遗传背景，适合个体化药物筛选，但难以大规模扩增；iPSC可无限规模化扩增，适合高通量筛选。

气道与肺泡类器官的生物医学应用

1.人源气道/肺泡肺类器官弥补了传统细胞系、啮齿类动物模型的物种差异与结构缺陷，TGF‑β/BMP/SMAD、FGF、Wnt/β‑catenin三大信号网络共同调控肺上皮干细胞的增殖与谱系分化；

2.iPSC与AdSC两种来源肺泡类器官各有优劣，共同为呼吸系统病毒感染（如SARS‑CoV‑2）、遗传性肺病、肿瘤提供了优秀的体外研究工具；但当前肺类器官仍缺失血管、完整免疫细胞组分，技术成本高、成熟度不足，未来需要开发共培养、多系统整合类器官体系，才能充分实现其在疾病机制、高通量药物筛选、再生医学转化价值。

参考文献：Human lung organoid: Models for respiratory biology and diseases Wenhao Yanga, Yingna Lia, Fang Shia, Hanmin Liu