基因编辑小鼠繁育与鉴定实操：配繁策略 + 基因型鉴定！

拿到KO、Flox、Cre或CRISPR编辑小鼠后，后续实验能不能顺利开展，一个重要前提是繁育方案的设计。配繁组合不合理，可能连续几窝都拿不到目标基因型；PCR只看一条阳性带，也可能把杂合、纯合甚至错误编辑的动物混进正式实验。

在开始繁育前，先把将最终实验鼠和对照鼠的完整基因型写出来，再倒推每一代需要什么亲本。

1. 常规KO小鼠

如果杂合子记作+/−，常见配繁方式为：

以上比例建立在等位基因正常孟德尔遗传、不同基因型均能存活的前提下。如果纯合KO出现胚胎致死、不育或繁殖力下降，就要保留杂合繁育，不能直接用−/−维持种群。

2. Flox小鼠

Flox等位基因本身通常用于后续条件敲除。Flox/Flox动物健康且可育时，可以采用Flox/Flox × Flox/Flox维持基础种群，这样后代全部保留纯合Flox基因型。

正式做条件敲除时，再将Flox系与对应Cre系组合。

3. Cre × Flox条件敲除

先将Cre鼠与Flox/Flox小鼠交配，获得 Cre+;Flox/+ 后代，再与Flox/Flox小鼠回交。以Cre为单拷贝、各等位基因正常分离为例：Cre+;Flox/+ × Cre−;Flox/Flox。

后代中约有：

其中 Cre+;Flox/Flox 常作为条件敲除实验鼠，Cre−;Flox/Flox 可以作为常用同窝对照之一。

Cre通常一份拷贝即可完成重组，不需要默认把Cre繁到纯合。部分Cre品系还存在生殖系重组、异位表达或亲本来源效应，因此由雄鼠还是雌鼠携带Cre要先查具体品系资料。某些Cre系使用Cre阳性雄鼠配繁可以降低生殖系意外重组风险，但不能作为所有Cre品系的固定规则。

4. CRISPR Founder小鼠

CRISPR获得的F0 founder不能简单按普通杂合鼠处理。F0可能存在嵌合，尾尖或耳组织检测到的编辑类型，不一定就是生殖细胞最终传递的等位基因。

因此F0通常先与WT小鼠配繁获得F1，再对F1进行PCR和测序，确认编辑是否发生生殖系传递，并明确具体序列。多个F0 founder最好分别建立后代，不建议直接用不同founder互配。

基因分型常使用耳组织或尾尖取样，不同动物之间及时清洁取样器械，避免组织残留造成交叉污染。

取样后进行基因组DNA裂解。PCR模板不需要追求很高浓度，但要避免大量蛋白、盐、乙醇或组织碎片残留，否则容易出现无扩增、条带弱或非特异扩增。

1. WT / Flox鉴定

Flox等位基因插入loxP后，PCR产物长度通常会发生变化。引物设计在插入区域两侧时，可以通过条带大小区分：

WT：WT条带；Flox/+：WT和Flox两条带；Flox/Flox：Flox条带。

实际条带大小完全由具体基因和引物位置决定，不能直接套其他品系的bp数。

2. KO等位基因鉴定

常见做法是使用三引物PCR：一个公共引物配合WT特异引物和突变等位基因特异引物，在同一体系或两个PCR体系中区分+/+、+/−和−/−。

如果KO由较大缺失、插入或复杂重排形成，PCR设计需要根据实际编辑结构调整。

3. Cre鉴定

Cre转基因通常进行Cre阳性/阴性PCR。常规PCR很多时候只能判断是否携带Cre，并不能可靠区分半合子和纯合子。实验是否需要区分Cre拷贝状态，要结合具体Cre品系和繁育方案决定。

4. CRISPR编辑鉴定

小indel可以先进行PCR，再结合Sanger测序确认序列；点突变、KI或复杂编辑还需要根据项目设计进行等位基因特异PCR、测序或其他验证。

对于新建CRISPR系，在看到“PCR阳性”之后，还要确认插入方向、突变序列、接合位置及生殖系传递是否符合设计。

每次基因分型至少保留已知阳性、已知WT和无模板对照。出现条带位置异常时，先核对引物、模板质量、退火条件和PCR程序，再判断基因型。

同时建立“耳号—笼号—父本—母本—出生日期—基因型”对应记录。复杂的Cre/Flox或多基因杂交中，基因型不能只写“KO”“阳性”，要完整记录每个等位基因，例如：

Gene^fl/fl; Cre+

否则繁育到后面很容易丢失等位基因信息。

尾尖或耳组织PCR只能证明动物携带Cre和Flox等位基因，不能直接证明目标组织已经完成有效敲除。

正式实验前还需要在目标组织确认重组情况，可选择recombined allele PCR、qPCR、Western blot、IHC或IF。Cre表达具有组织特异性，同一个动物的尾部DNA可能仍显示完整Flox等位基因，而目标组织已经发生重组。

如果使用CreERT2，还要把他莫昔芬处理、诱导时间和对应处理对照一起纳入实验设计。

繁育连续几窝都拿不到目标基因型时，先重新计算理论分离比例，再检查纯合基因型是否存在致死或不育，以及多个等位基因是否位于同一染色体。两个位点连锁时，不能直接按独立遗传计算后代比例。

Cre/Flox实验出现异常基因型时，要排查生殖系重组；CRISPR founder的PCR结果复杂时，优先考虑嵌合；PCR出现无条带或多条杂带时，则先检查DNA质量、引物特异性和扩增条件，不急着根据异常条带判断新基因型。

基因编辑小鼠繁育可参考：先确定实验鼠和对照鼠的完整基因型，再设计最终交配组合，按理论比例规划动物数量，出生后完成PCR分型，并在正式实验前确认目标组织中的实际编辑效果。

常规KO重点看纯合是否存活可育；Cre/Flox重点控制Cre来源、生殖系重组和组织重组效率；CRISPR founder则要先完成F1生殖系传递和序列确认。