流式细胞实验设计：对照设置指南！

做流式细胞实验时，会遇到这些情况：阴阳性细胞分不开，换一种画门方式结果就变了，处理组的荧光增强也难以解释。本文以常规多色流式检测为例，按实验准备、对照配管和结果分析的顺序，讲清不同对照的用途。

实验开始前，先确定要分析的细胞群、检测指标，以及最终比较阳性细胞比例还是荧光强度。例如，观察刺激后CD4⁺ T细胞的CD69表达变化，需要先识别目标细胞群，再在该群体内分析CD69。

随后核对仪器的激光和检测通道，选择适配的荧光组合，并完成抗体滴定。抗体用量应以阳性群与阴性群的分离效果为依据，过量抗体可能增加背景，影响弱阳性群体的识别。

同时预留对照所需的样本。细胞数量有限时，可为适用的抗体选择补偿微球，但活死染料等试剂需要另行确认兼容的对照材料。

Step 1｜设置生物学对照，确定比较基准

生物学对照用于判断处理带来的变化。药物实验通常设置溶剂对照；刺激实验设置未刺激对照。两组应采用一致的培养、收集和染色流程。

建立新检测体系时，还可加入已知阳性样本，验证检测体系能否识别目标信号。已知不表达目标抗原的细胞或基因敲除样本，则可帮助评估染色特异性。

生物学对照通常需要完整染色。例如，未刺激组同样加入全部检测抗体，才能与刺激组直接比较。它与完全不加荧光试剂的未染对照承担不同任务。

Step 2｜准备未染对照，观察样本本底

未染对照不加入荧光抗体和荧光染料，主要用于观察自发荧光，并辅助检查散射光分布和仪器设置。

未染样本应尽量匹配实验样本的细胞类型及处理流程。药物处理、细胞活化和固定等操作，都可能改变自发荧光；出现这类变化时，应分别准备相应的未染样本。

分析时，先观察未染细胞在各通道中的分布，再结合其他对照判断阳性边界，避免把样本本底计入目标信号。

Step 3｜准备单染对照，计算荧光补偿

一种荧光染料发出的信号可能被多个检测通道接收。常规多色流式通过补偿校正这部分信号溢出，计算依据来自单染对照。

面板中的每种荧光染料都应有对应的单染对照，包括活死染料。配管时，每管只加入一种荧光试剂，并确保：

使用与实验样本一致的荧光染料；串联染料尽量使用同批次试剂。

阳性信号足够明亮，达到或超过实验样本中的相应信号，同时避免超出检测范围。

对照中的阴性和阳性群体具有匹配的本底。

固定、洗涤和保存等条件与实验样本保持兼容。

抗体捕获微球可用于适配的荧光抗体；其他染料需使用兼容微球或染色细胞。完成补偿后，应检查各单染群体的分布，确认计算结果合理。

图1丨荧光补偿前后对比图

Step 4｜针对关键指标设置FMO对照

荧光减一对照（fluorescence minus one，FMO）保留面板中的其他荧光试剂，只去掉待判断指标对应的试剂。

例如，检测CD3、CD4和CD69时，CD69的FMO管加入CD3、CD4抗体，去掉CD69抗体；若面板包含活死染料，FMO管中也应保留该染料。

这管样本可以显示：在完整染色背景下，其他荧光信号对CD69所在通道的分布产生了多大影响。将它与全染样本放在同一目标细胞群中比较，有助于确定阳性门。

弱表达、连续表达、阴阳性界限不清，以及决定关键分群的指标，应优先设置FMO。是否需要FMO，应结合分群难度和面板验证结果决定。单染对照用于补偿，FMO用于辅助画门，两者各有用途。

图2丨FMO 对照阳性门划定对比图

Step 5｜按需加入同型对照

同型对照采用与目标抗体相匹配、但不识别样本目标抗原的抗体，辅助评估部分非特异性结合背景。选择时需关注抗体种属、免疫球蛋白类型、亚型、荧光标记及使用浓度。

同型对照有其局限：即使这些条件接近，两种抗体的聚集程度、标记比例和非特异性结合仍可能不同。因此，同型对照不宜单独作为阳性门的依据，也不必在每次实验中机械设置。

对于Fc受体相关背景，应结合样本特点安排Fc受体封闭；采用未标记一抗加荧光二抗的间接染色时，还应设置仅加二抗的对照。

假设比较刺激前后CD4⁺ T细胞的CD69表达，采用CD3、CD4、CD69三种荧光抗体，并加入一种活死染料，可按下表准备：

在实际对照数量还取决于样本处理、检测指标和验证结果；同一批次中的部分技术对照可在条件匹配并经验证后共用。

上机前完成仪器质控，确认样本状态和对照信号。分析时，可依次检查采集稳定性、细胞群、单细胞和活细胞，再进入目标群体。例如，在活的单细胞中识别CD3⁺CD4⁺群体，随后比较CD69。

画门应结合相应对照，并在可比样本间采用一致的判定规则。阳性比例适合边界明确的群体；连续表达的指标，还可结合荧光强度分布分析。报告结果时，应注明所用的强度统计量。

保存数据时，建议同时保留原始FCS文件、补偿矩阵、完整门控流程、抗体信息及仪器设置，便于复核和重复实验。

图4丨死细胞与粘连体去除示意图