【五分钟讲实验】流式检测常见问题分析及解决方案！

1. 信号补偿不正确：

检查流式细胞仪上单色阳性对照是否设置正确，以及门控和补偿设置是否正确，确保能捕获所有事件。

2. 补偿过高/增益过低：

使用阳性对照正确设置流式细胞仪，利用补偿确保细胞的荧光信号不被切断，提高增益以增强信号（在合理范围内，应谨慎操作）。

3. 抗体问题：

抗体可能存放太久或没有避光，导致荧光淬灭。此外，一抗和二抗可能不匹配，应确保使用的二抗与一抗来源种属不同。

选择一抗（主要抗体）和二抗（次要抗体或荧光标记抗体）时，必须考虑它们的种属特异性。下面是一个根据不同种属差异选择一抗和二抗的示例表格：

在选择一抗时，需要根据目标抗原和种属特异性来挑选。例如，如果要检测小鼠细胞上的抗原，则应该选择小鼠特异性的一抗。

在选择二抗时，需要确保二抗能够识别一抗的来源。例如，如果一抗是小鼠来源的IgG，那么二抗应该是抗小鼠IgG的。此外，二抗通常带有荧光标记（如FITC、PE、APC等），以便于在流式细胞仪上检测。

1. 抗体工作浓度过高：

摸索抗体最佳使用浓度，做抗体滴定实验，减少每个样本中添加的抗体量，以避免强非特异性结合或高荧光强度。

2. 非特异性结合：

抗体的非特异性结合能力较强，增加FC受体封闭试剂，减少抗体FC段对细胞表面FC受体的非特异性结合。

1. 细胞固定和透化：

不适当的固定和透化条件可能导致细胞结构破坏，从而影响抗原与抗体的结合。因此，应根据所使用的抗体和细胞类型优化固定和透化条件。

2. 细胞存活率问题：

如果样本中存在大量死细胞，可能会影响流式结果。确保样本处理过程中细胞的存活率，并在流式分析时设置适当的门控来排除死细胞。

3. 样本污染：

确保样本在处理和存储过程中无污染，包括细菌、真菌和其他污染物。

在进行多色流式实验时，不同荧光染料之间可能存在颜色重叠的问题。这可能导致信号间的干扰和误读。为了避免这种情况，应选择光谱重叠较小的荧光染料，并使用流式细胞仪的补偿功能来纠正染料间的干扰，根据所要检测指标的表达强弱配置合适荧光强度的荧光素标记抗体。

不同的样本批次之间可能存在差异，如细胞密度、细胞大小、抗原表达水平等。这些差异可能影响流式结果的准确性和可重复性。为了减少批次差异，建议在实验设计中包含相应的对照样本，并使用标准化方法来处理和分析数据。

在流式实验中，非特异性结合是一种常见的干扰因素。这可能导致背景信号升高，影响对抗原表达的准确测量。为了减少非特异性结合，可以使用封闭剂（如FCS、BSA等）来封闭抗体与细胞表面非特异性结合位点，并优化抗体的浓度和孵育时间。

背景噪声是流式实验中另一个需要注意的问题。它可能来自于仪器本身、样本处理过程中的污染、非特异性结合等因素。为了减少背景噪声，需要保证实验环境的清洁和无菌操作，使用高质量的试剂和耗材，并合理设置仪器的参数和阈值。

样本的处理和保存对流式细胞术实验的结果有着显著影响。不正确的样本处理可能导致细胞死亡、抗原丢失或降解。因此，需要遵循严格的样本处理流程，包括正确的采集、运输、保存和标记样本。对于需要长期保存的样本，应使用适当的保存方法和条件，如低温冷冻、添加保护剂等。