【五分钟讲实验】Ⅱ型糖尿病心肌病动物模型构建技巧详解！

糖尿病患病率是全球增长最快的疾病之一。据国际糖尿病联合会估计，到2030年，糖尿病患者人数将增加到5.784亿，发病率将高达10.2%。超过90%的糖尿病为2型糖尿病，其特征是在疾病后期出现外周胰岛素抵抗和糖代谢障碍。糖代谢障碍具有两种潜在机制：一种是促进冠状动脉粥样硬化性狭窄的发展，从而导致以收缩功能障碍为特征的缺血性心脏病；另一种是糖尿病的经典表现，即糖尿病心肌病（DCM）。

DCM是在没有高血压、冠状动脉疾病和其他心血管疾病的情况下出现的心功能不全，主要以心室功能障碍、心肌间质纤维化和心肌细胞肥大为主要特征。DCM患者早期症状多表现为左心室肥厚和舒张功能障碍，逐步发展至以心脏纤维化和收缩功能受损为特征。DCM的病理生理学是复杂的，涉及多种机制，如炎症、线粒体功能障碍、细胞死亡、氧化应激、脂毒性、纤维化和胰岛素信号中断。由于这些病理生理变化，心脏被迫重塑并减少心排血量。

1. 实验材料

① 动物：6-8 周龄 C57BL/6雄性健康小鼠，体重20-25g；

② 药品：STZ粉末；

③ 试剂：0.1M柠檬酸钠缓（pH=4.5）。 

2. 操作

① 适应性饲养一周后，将普通饲料更换为高脂饲料，继续饲养8周后，禁食不禁水12h，记录小鼠的体重和空腹血糖值。 

② 根据小鼠体重，以75 mg/kg给药剂量，腹腔注射STZ溶液，连续给药3天。每次注射前，均需禁食不禁水12h。 

③ 按浓度为5mg/mL配制STZ溶液，现用现配且在30 min内注射完毕，注意严格避光，全程在冰上操作。 

④ 造模7d后，尾部取血测量空腹血糖。若血糖值≥11.1mmol/L视为糖尿病造模成功。继续给予糖尿病小鼠高脂饲料饲养4~8周。

1. 生理生化指标

① 一般性指标：多饮、多食、多尿、体重下降；

② 其他指标：空腹血糖≥11.1mmol/L或随机血糖≥16.7mmol/L；

③ 血清指标：TC、TG、HDL-C、LDL-C等。

2. 心脏取材评价

① 心脏指数测定：实验末期，禁食12 h实验鼠以异氟烷吸入麻醉后仰卧位固定，取血，生理盐水灌注完毕后迅速处死，取出心脏，预冷盐水反复冲洗后剪除包膜和血管，用电子天平称质量并计算心脏指数和左心室质量指数。

② 心脏指数（HMI） (mg/g) = 心脏质量/体质量

③ 左心室质量指数（LVMI） (mg/g) = 左心室质量/体质量

3. 病理染色

① H&E染色：给予STZ四周后，随机选取2只小鼠处死，对心肌组织进行HE，观察心肌细胞形态改变。

与空白对照组相比，模型组大鼠心肌细胞肥大、排列紊乱、有大量炎性细胞浸润，且有心肌纤维断裂、溶解等情况，心肌细胞横截面积明显增大（P <0.05）。

② Masson染色：给予STZ四周后，随机选取2只小鼠处死，对心肌组织进行Masson染色，观察心肌胶原的沉积情况、心肌纤维化程度。

③ TUNEL染色：组织-心脏，选择随机5个视野中阳性细胞百分率计算细胞凋亡率。

细胞凋亡率=阳性细胞数÷细胞总数×100%

4. 心脏超声检测

① 检测小鼠心功能，记录超声心动图参数；

② 左室舒张末期内径（LVEDD）、舒张期左室后壁厚度（LVPWT）、左室收缩末期内径（LVESD）、左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS），每个测量值，取三个心动周期的测量平均值。

③ 与对照组相比，DCM 组LVPWT、LVEDD、LVESD 水平升高（P＜0.05），LVEF和LVFS水平降低（P＜0.05），差异有统计学意义，说明小鼠心脏收缩功能显著下降。

5. 电镜检测

① 检测小鼠心肌超微结构

② 电镜下观察正常对照组大鼠肌原纤维无水肿，肌小节结构正常，排列整齐，线粒体无肿胀，嵴突致密、发达，心肌内单毛细血管内皮形态结构正常；

③ DC 组小鼠肌原纤维肿胀，明显溶解、断裂，肌小节破坏，肌膜下大面积灶性变性坏死，线粒体肿胀，大部分嵴和少部分膜融合、模糊不清，部分嵴和膜有断裂和缺失现象，单细胞毛细血管内皮肿胀，心肌间质水肿，可见胶原纤维增生。

1. 根据小鼠体重和数量提前称量STZ冻干粉，分装在干燥离心管中，外用锡纸包裹。

2. 将装有0.01M柠檬酸钠缓冲溶液（pH4.2-4.5）和STZ冻干粉的离心管一起置于碎冰中。注射前混匀，且在30min内注射完毕。因为STZ不稳定，容易失活。

3. 根据小鼠的数量和操作熟练度，分组制备STZ溶液，避免一次性溶解STZ影响成模率。

4. 给予STZ后72小时，测量空腹血糖；若不达标者，再观察3天，仍未成模者，重新注射一次。

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