类器官转录组测序（RNA-Seq）

RNA-Seq技术，全称为：RNA sequencing，是通过高通量测序手段，即二代测序技术（NGS），来检测某一特定时间点，生物样品中RNA的表达情况及定量的方法，可以用来研究分析细胞转录组在不同组织样品间基因表达差异情况、在时间轴上不同时间点连续的变化，以及转录本的可变剪切和SNP位点等。除了mRNA转录本信息，RNA-Seq技术可以用来研究不同类群的RNA，包括miRNA，tRNA，rRNA，lncRNA等。

RNA-Seq的最新进展还包括单细胞转录组学（single cell sequencing）和固定组织的原位测序（in situ sequencing of fixed tissue）。

文库构建

构建RNA-seq文库，主要分为以下几步：

1、提取总RNA

2、反转录成cDNA

3、磁珠纯化cDNA

4、末端补平

5、连接测序接头

6、PCR扩增

7、磁珠纯化DNA

8、上机测序

分析流程

对于RNA-Seq数据，首先利用fastqc软件对原始数据进行质量评估；再使用STAR软件将原始数据比对到参考基因组；然后用cuffdiff软件分别对每例样本进行表达量计算，并对基因进行注释，差异基因分析（比较不同组之间的差别）。

随后通过R包（如DEseq2，edgeR等），对差异基因数据进行进一步分析，并对靶基因进行GO和KEGG富集分析。

结果案例：

一、神经类器官形态发生素模式的单细胞转录组图谱

成功构建涵盖多种处理条件的单细胞转录组数据集，鉴定出端脑、间脑、视网膜、下丘脑、后脑、脊髓等多个中枢神经系统区域的祖细胞和神经元，以及神经嵴、非神经外胚层等细胞类型（图1c-e）；未处理的对照类器官以神经簇为主（图1f），而形态发生素处理后可诱导出对照中缺失的后脑、下丘脑等区域细胞及非神经组织（图1g-i）；多数形态发生素处理条件下细胞类型具有多样性，高浓度形态发生素并非单纯提高同质性，而是诱导新细胞类型替代初始细胞类型。

图1 人类神经类器官模式的单细胞转录组图谱

二、形态发生素时间和浓度对神经类器官区域细胞身份的影响

RA的时间效应具有双向性：早期处理（早于9天）促进非神经外胚层形成，晚期长期暴露（9-20天）则诱导视网膜和后脑祖细胞（图2a、c）。早期和中期（0-3天、10-13天、14-17天）抑制WNT通路（XAV939）能显著富集端脑祖细胞。FGF8早期（3-14天）处理富集端脑命运，晚期（12-20天）长期暴露则耗尽端脑命运。在特定时间点以短脉冲形式施用SHH时诱导端脑细胞分化的模式化窗口更局限于早期，晚期单次脉冲处理更倾向产生视网膜祖细胞，同时轻度富集端脑身份。

低浓度（c2-3）促进视网膜祖细胞（SFRP2+），高浓度则逐步富集后脑和后底板祖细胞（FOXA2+）（图2c）。BMP4浓度升高会增加视网膜祖细胞比例，且效果优于BMP7；BMP7虽也能剂量依赖性诱导视网膜祖细胞命运，但效率较低。持续升高SHH浓度，会使细胞从端脑祖细胞逐步转变为下丘脑祖细胞，高浓度时还会产生下丘脑底板细胞。高浓度CHIR除诱导神经嵴命运和外周神经系统神经元外，还会引导细胞向间充质等非神经身份分化（图2b）。

早期（0-3天）处理时，BMP4导致类器官解体，BMP7则使间充质细胞富集近90%；3天后处理，BMP4诱导非神经外胚层并逐步导向视网膜命运，BMP7则倾向维持细胞多能性。SHH对端脑的腹侧化和前侧化效应强于FGF8，且SHH暴露能诱导FGF8表达，但FGF8处理无法诱导SHH或自身表达。

图2 形态发生素的时间和浓度决定了发育中的神经类器官的区域细胞特性

三、形态发生素对转录因子调控网络的差异化激活

鉴定出与不同形态发生素相关的调控网络，部分调控网络与多种形态发生素相关（如GATA3、GLI1与SHH和RA均相关）。SHH和RA相关调控网络对时间和浓度均高度依赖（图2f），FGF8相关调控网络主要依赖浓度（图2g），BMP4/BMP7相关调控网络更依赖时间。

NKX2-1调控网络（MGE形成关键）需高SHH浓度激活，TCF7L2调控网络（丘脑发育关键）仅在SHH晚期高浓度下激活（图2f,h）；视网膜调控网络VSX2、VAX2的活性不依赖FGF8和BMP4的处理参数（图2g,h）。

四、形态发生素组合模式的筛选及相互作用

设计沿前后轴（AP）和背腹轴（DV）的形态发生素组合方案，XAV939、RA、CHIR调控AP轴，cyclopamine、SHH调控DV轴，FGF8辅助生成特定边界区域（图3b）。CHIR在两种细胞系中均诱导非神经命运，RA均诱导后底板，但WTC对XAV939更易产生端脑祖细胞，HES3则倾向产生非神经外胚层（图3a）。XAV939与SHH组合协同增加非神经外胚层比例；RA与SHH组合中，高SHH浓度显著增加后底板祖细胞，而FGF8可逆转该效应，促进后脑祖细胞形成（图3f）。

图3 形态发生素组合调节神经细胞命运

五、人多能干细胞系和神经诱导方法对模式化结果的影响

设计包含4种细胞系（H1、H9、WIBJ2、WTC）、2种神经诱导方法（MNIM、双重SMAD抑制）和2个技术批次的可重复性筛选，分析209,902个细胞（图4b、c、e-g）。实验批次间重复性良好（图4d），双重SMAD抑制条件下类器官变异性高于MNIM（图4i），高浓度形态发生素处理可降低细胞系间变异性（图4j）。MNIM生成多种神经外胚层和非神经外胚层组织，重复性更高。双重SMAD抑制更倾向产生中枢神经系统命运，但细胞系间差异更显著。高浓度SHH和RA在不同细胞系和诱导方法中均产生相似的AP-DV轴调控效应（图4l），低浓度或弱模式化条件（如低浓度FGF8、SHH）则一致性较差。

图4 形态发生模式的结果受PS细胞系和NIM的影响

六、调控子水平上细胞系和 NIM 的可重复性评估

早期采样（21天）捕捉到早期神经系统区域化相关调控子的激活，为每种神经诱导方法构建了全局调控网络。部分调控子活性在细胞系间表现一致：RA激活的颈部HOX基因HOXB3、CHIR激活的胸部HOX基因HOXC6，以及SHH处理下均下调的GLI3调控子（与人脑背腹轴模式形成相关）（图5a）。在细胞系和诱导方法间，FOXG1、RFX2和POU3F2分别是CHIR、SHH和RA刺激下变化最大的调节子之一（图5b）。同一种子细胞系在MNIM和双重SMAD抑制下，部分调控子响应相反（如CHIR处理时，HOX调控子在双重SMAD条件下激活、MNIM中下调）（图5c）。RA和FGF8在两种诱导方法中一致性最高，RA诱导的HOX调控子在细胞系和诱导方法间均稳定激活；SHH相关关键调控子（如OTP、ARX）的响应在细胞系和诱导方法间差异较大。干细胞类型（hiPS/ES）和核型（XX/XY）对调控子活性无显著影响（图5c）。

图5 hPS细胞系和NIM中可变和一致的调控子

七、形态发生素梯度对前脑背腹轴比例的影响

采用微流控梯度发生器（MiSTR）构建连续SHH梯度，与96孔板中离散浓度处理对比，探究前脑背腹轴模式形成（图6a、b）。两种系统均能再现前脑背腹轴模式，但细胞组成比例不同：MiSTR组织以端脑背腹命运为主，类器官则以间脑腹侧命运为主（图6f）。低SHH区域产生皮质/外侧神经节隆起祖细胞，高SHH区域诱导内侧神经节隆起、下丘脑和底板细胞（图6g，h）；类器官的腹侧化效应强于微流控系统（图6i）。时间点分析显示，MiSTR系统呈现渐进式区域特化，而类器官在达到特定SHH浓度阈值后会直接转向下丘脑样特征，提示类器官中存在SHH信号增强的前馈机制。

图6 形态发生素梯度和不连续的形态发生素阶梯同样重现了人类前脑的DV模式