类器官-免疫细胞共培养模型

肿瘤类器官-免疫共培养模型由三大核心组分构成：肿瘤细胞、免疫细胞及细胞外基质（ECM）（图1）。肿瘤细胞可来源于患者或已建立的癌细胞系，其中患者来源类器官（PDOs）具有更高的患者特异性关联。免疫细胞组分可包含外周血单个核细胞（PBMCs）、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）或经工程化改造的免疫细胞（如CAR-T细胞），用于探索特定免疫应答。ECM通常由Matrigel或胶原蛋白等水凝胶构成，既能提供三维结构支撑，又可调控细胞行为特征。为更好模拟体内复杂环境，共培养模型可整合癌症相关成纤维细胞（CAFs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）或内皮细胞等肿瘤微环境组分。这些组分的精准筛选与组合对准确模拟肿瘤-免疫互作机制、探索癌症免疫治疗策略具有决定性作用。

1、类器官准备

1）提前一周，复苏培养类器官至状态良好；

2）取合适数量类器官，使用预冷PBS清洗数次，去除大部分基质胶；

3）使用培养基重悬类器官。

2、PBMC分离和类器官共培养

（1）外周血在无菌环境下，使用添加EDTA-K2的真空采血管采集，运输保存；

（2）将新鲜静脉血与PBS缓冲液1：1 稀释，轻轻混匀待用。

（3）添加4ml细胞分离液（Absin abs930），缓慢加入静脉血混合物8ml，静置待用。

（4）2000rpm 离心20min，在此过程中升降速度降至1，避免产生细胞融合。

（5）此时观察到15ml离心管为4层，轻轻吸取第2层白色悬浮物于15ml 离心管，混匀待用。

（6）1500rpm 离心10分钟，在此过程中升降速度降至1，避免产生细胞融合，弃上清。

（7）添加适量T细胞无血清基础培养基静置培养观察。T细胞无血清完全培养基的配置：向T细胞无血清基础培养基里添加IL-2（Absin abs05543）200-500单位/ml (刺激T细胞生长与增殖)， CD3/CD28磁珠（Absin：abs160019）3ug/ml（激活T细胞）。

5）使用T细胞无血清完全培养基，悬浮调整至合适浓度，96孔板，每孔约加入5*105 活T细胞，100uL体积；

6）重悬类器官混合液，分别加入等量的样至96孔板中，至总体积200uL。

3、培养观察

1）D0观察记录类器官和T细胞状态；

2）37℃，5% CO2条件下培养，每日连续观察；

3）D3吸出100uL培养上清，加入100uL新培养基，同时加入（处理抗体或药物）使至终浓度100nM（如果D3已出现显著差别，则记录大视野明场形态，终止实验）；

4）观察至实验组间差异显著，拍照记录大视野细胞明场形态；

5）细胞上清保存用于后续检测

4. 腹膜癌类器官与TIL细胞共培养

TIL细胞可被腹膜癌类器官激活，并对类器官具有杀伤作用。14h后，类器官的荧光信号明显下调。

TIL细胞（绿色）杀伤腹膜癌类器官（红）

5. 乳腺癌类器官与TIL细胞共培养

Caspase-3/7（绿色）标记乳腺癌类器官，共培养4h后凋亡细胞显著增多。

成像分析用于测定共培养物中类器官凋亡情况

3. 胃癌类器官与NK细胞共培养

NK细胞（红色，细胞膜，DIL）可被胃癌腹水来源的类器官（蓝色，细胞核，Hoechst 33342）激活，并对类器官具有杀伤作用。12h后，NK细胞的荧光信号显著上调，24h后类器官的荧光信号明显下调。

NK细胞（红）杀伤胃癌类器官（蓝）