成纤维原代细胞提取

原代成纤维细胞是生物学研究的重要细胞类型，其提取与应用一直是科研领域的热点。

在开始原代成纤维细胞的提取之前，我们需要了解其基本原理和技术要求。首先，选择适当的组织样本是关键，因为不同的组织来源会影响细胞的性质和后续实验结果。接下来，我们需遵循一系列严格的步骤，包括组织消化、细胞分离、纯化与培养等，以确保成功提取到高质量的原代成纤维细胞。

小鼠肺成纤维原代细胞

小鼠肺成纤维原代细胞

一、原代成纤维细胞提取的步骤

A、取材

1、超净工作台内将人源结肠癌组织放置于含有双抗（青霉素200-1000U/ml、链霉素500ug/ml）及两性霉素（2ug/ml）的PBS中浸泡10分钟并反复冲洗约5遍直至液体相对澄清。

2、将冲洗后的组织块用无菌眼科剪去除组织块中的脂肪及坏死组织，起到二次清洁的效果。

B、组织块分离

1、剪切分离：将经过修整和冲洗的组织块放入小皿中，用眼科剪反复剪切，直至全部形成大约1mm³体积的小块，剪切过程中需要保持组织块湿润。将剪切好的组织块放入15ml离心管后，置于离心机中进行离心，速度为1000rpm，5mins。

2、消化分离：离心完成后，按离心后组织块的体积加入约5倍体积组织量的IV型胶原酶反复吹打。打开37℃恒温摇床进行震荡加热60mins。

消化后用巴氏吸管吹打离散2mins，置于离心机中进行离心，速度为1000rpm，5mins，离心后弃胶原酶并用2X双抗DMEM洗（中和）2遍。

随后将消化后的组织块重悬于含20％胎牛血清完全培养基中并平均置于小皿，各皿均以培养基不流动，恰好浸润组织块为佳，并放入37°，5％ CO²孵箱中。

放置1~2天，及时观察污染情况及生长情况。若在小皿中看到组织块周围已经有成纤维细胞长出且长到80％,通过时间差酶消化及反复贴壁法再次传代。使胰蛋白酶流过所有细胞表面（小皿用500ul 胰酶），在显微镜下观察当成纤维细胞变圆并部分脱落时, 立即加入2ml完全培养液终止消化，不经吹打直接将细胞悬液传入新的培养瓶中。

二、原代成纤维细胞的鉴定

1、形态学观察

镜下观察成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。

2、细胞爬片的免疫组化染色

细胞爬片分别以cytokeratin（AE1/AE3）（细胞角蛋白广谱）、Vimentin（波形蛋白）、α-SmoothActinMuscle（α-平滑肌肌动蛋白）标记，采用S-P法（链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶连接法）进行检测。

3、Western Blot

α-SmoothActinMuscle（α-平滑肌肌动蛋白）是癌相关成纤维细胞特异表达的标志，Vimentin（波形蛋白）是检测成纤维细胞的特异标志，在进行Western Blot实验时，鉴别癌相关成纤维细胞与肿瘤细胞，可以根据肿瘤细胞的属性来源（如HCT116细胞为上皮来源的肿瘤细胞），选择相应的蛋白标志进行检测，如上皮细胞的标志为E-cadherin，那么理论上所提癌相关成纤维细胞则不表达E-cadherin，只表达α-SmoothActinMuscle及Vimentin。

三、经验分享

1、尽量避免操作不当导致的细胞污染，可以适当增加冲洗次数，手术剪及镊子每次均及时消毒灭菌。

2、消化震荡时间要充分，组织块尽量剪小。