外周血PBMC分离提取

外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC）是免疫学、肿瘤学及相关领域研究中的核心材料。PBMC主要包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和单核细胞等，是外周血中关键的免疫细胞群体。通过密度梯度离心法，我们可以高效地从外周血中分离出PBMC，为后续的细胞培养、功能分析或冷冻保存提供高质量的细胞样本。

PBMC分离流程 

样本准备
为避免血液凝固，需使用抗凝剂处理样本，常用抗凝剂为EDTA。采集时，需确保采血过程无菌，并尽快进行后续操作，以减少细胞活性的损失。

血样稀释
将采集的外周血样本与无菌平衡盐溶液按 1:1 的比例进行稀释。稀释时需轻柔混匀，避免产生气泡或破坏细胞。建议在无菌操作台内完成此步骤，以确保实验环境的洁净。

密度梯度离心
密度梯度离心是PBMC分离的核心步骤。操作时，在15 ml或50 ml离心管中加入等体积的密度梯度介质。随后，小心将稀释后的血样沿离心管壁缓慢加入，使其层叠在Ficoll-Paque液面上，确保两者界面清晰，避免混合。

离心操作
将装有血样和Ficoll-Paque的离心管置于离心机中，设置离心参数为400 g，30分钟，室温（18-25°C）。为防止分层界面被扰乱，离心时需关闭离心机的制动功能。离心结束后，血液将分层：底部为红细胞层，中部为Ficoll-Paque层，顶部为血浆层，而PBMC则形成一层白色的雾状环，位于Ficoll-Paque与血浆的界面处。

PBMC收集
使用无菌的巴斯德吸管或移液枪，小心吸取白色雾状的PBMC层，转移至新的离心管中。操作时需轻柔，避免吸入过多Ficoll-Paque或血浆，以免影响后续实验的纯度。

PBMC洗涤
为去除残留的Ficoll-Paque、血浆成分及其他杂质，需用平衡盐溶液（如 D-PBS）对PBMC进行两次洗涤。加入适量D-PBS（约10 ml），轻柔混匀后，以 300 g，10分钟 的参数离心，弃上清。重复此步骤，确保细胞干净。

细胞计数与活力检测
洗涤后的PBMC需进行细胞计数和活力检测，以评估细胞质量。推荐使用 台盼蓝染色法，通过显微镜观察活细胞（不被染色的细胞）与死细胞（被染成蓝色的细胞）比例。结合血细胞计数板，准确计算PBMC的浓度和存活率。

PBMC保存与应用
分离后的PBMC可根据实验需求直接用于细胞培养、流式细胞术分析或功能实验。

注意事项

无菌操作：整个分离过程需在生物安全柜内完成，避免污染。

时间控制：血液采集后应尽快进行分离，最好在4小时内完成，以确保细胞活性。

温度管理：除冷冻保存外，分离过程建议在室温下进行，避免温度变化对细胞活性的影响。

离心参数：离心速度和时间需严格控制，过高的离心力或过长的离心时间可能导致细胞损伤。