宫颈癌类器官

宫颈癌类器官（organoids）是指利用宫颈肿瘤细胞等在体外培养出的3D细胞培养物并具有一定的空间结构组织类似物。宫颈癌类器官可以作为疾病模型，相较于传统2D疾病模型，其在阐明疾病的发展、稳态性和发病机理等与体内环境更加接近，能作为宫颈癌治疗、诊段和发病机制研究的理想试验模型。

宫颈癌类器官构建实验步骤

1、取材：标本离体后，尽快取材。采用无菌器械，保证无菌环境，将肿瘤组织放入含有5 mL的原代组织保存液的 15 mL 离心管中，4℃转运；

2、清洗：在生物安全柜中取出样品管，去除组织保存液，加入适量冷的添加有双抗的 PBS，反复清洗后，去除 PBS；

3、重复清洗：重复第 2 步骤 3 次；

4、组织处理：去除 PBS缓冲液后，将组织块移至10 cm含10 mL冷原代 组织保存液的无菌培养皿中，用无菌眼科显微剪将组织剪碎（直径约 0.5mm~1mm）；

5、重复清洗：使用常温PBS，重复第2步骤3次；

6、收集组织碎片，加入组织消化液消化20~30 min，过70 μm筛网，收集宫颈癌细胞；

7、红细胞裂解：加入10 mL红细胞裂解缓冲液，室温下在翘板摇床上摇10 min；

8、重复清洗：裂解完毕，使用常温 DMEM/F12，重复第 2步骤3次；

9、类器官种板：调整细胞密度为2~3×106，与基质胶1:1均匀混合，将细胞混悬液以40-60 uL每孔种在24孔板中，37℃放置15~30 min，加入预热的类器官培养液，每个孔 750 uL；

10、类器官培养：将培养板放在 37℃  CO2培养箱培养,每2天更换培养液。加入培养液时，吸头朝向侧壁，缓慢加入；

11、类器官观察：每天观察类器官并拍照，了解初始类器官数量、增殖速度、形态、微生物污染情况等。

实验结果

注：P为代次，d为培养天数

常见问题

 Q ：基质胶的操作要注意哪些事项？

所有操作需在无菌环境下进行，应使用预冷的移液器以保证基质胶呈匀浆状。

Q ：获取临床样本，如何避免污染？

①取材时尽量保证无菌取材；

②提取前可以用含双抗的PBS浸泡几分钟：常见与外界环境有接触可能的胃、肠、膀胱等位置肿瘤建议用含3%~5%双抗的PBS浸泡5-10 min，其他常见肿瘤用含1%~2%双抗的PBS浸泡5min左右；
③提取细胞过程中所用试剂均加1%双抗及合适浓度的原代抗生素。

Q ：肿瘤组织采集、保存、运输注意事项

尽可能多采集肿瘤细胞含量高的肿瘤组织，并缩短组织样本在空气中暴露的时间，以减少污染概率；采集的肿瘤组织样本尽快置于装有专用样本保存液的无菌管中，低温（4 ℃左右）下快速运转至检测单位（尽量保证采样后2~4 h内送到）。

Q ：病灶和癌旁培养出的类器官有区别吗？肿瘤组织的取材部位有什么要求？

有差别，肿瘤本身具有异质性，不同来源的类器官之间存在差异是很常见的现象，从形态上看，原发病灶来源的类器官比癌旁来源的类器官更具有侵袭性的结构，一般病灶形态上更加不规则一些。如果希望在建模或药物筛选方面尽量减小误差，可以在活性好的地方多位置取样。