肺癌类器官

肺癌是全球发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一。近年来，免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）显著改善了部分晚期肺癌患者的预后，但总体的患者客观缓解率仍有待提高，亦凸显了预测肿瘤患者临床免疫疗效的必要性。然而，现有预测指标（如PD-L1表达、T细胞浸润程度、肿瘤突变负荷等）仍然普适性不足，难以精准指导免疫治疗。

越来越多的研究发现，抗肿瘤免疫应答不仅受肿瘤局部微环境（Tumor microenvironment, TME）调控，还依赖外周免疫系统（如外周血、引流淋巴结等）的协同参与。因此，亟需建立一种能够系统纳入患者局部与外周免疫成分的体外肿瘤模型，为个性化治疗决策和机制研究提供支持。

一、肺肿瘤组织分离消化
1、分离消化液的配制
首先，你需要准备原代组织消化液。按照说明书的要求，将胶原酶 I 型和 IV 型以 400-1000 U/mL 的浓度混合，再加入核酸酶 5-20 U/mL。为了提升生长效率，还可以加入 10μM ROCK 抑制剂。

2、组织清洗
在超净台内，将组织从原代组织保存液中取出，放入 100 mm 无菌培养皿中，用含有双抗的 PBS 抽吸冲洗 3 次。

3、机械分离
使用无菌的剪刀和手术刀，将大块的组织分离成大约 1 mm3 的细小碎片或糊糜状。

4、组织消化
将机械消化的组织转移到 15 ml 无菌离心管中，按照 1：4 的体积比加入适量组织消化液。用 1 ml 枪头轻轻吹打组织，使其充分分散。然后将其放置在恒温空气浴的摇床上，于 37℃ 下，120rpm 消化分离 30 min。每 5 min 取出观察分离效果，待大部分组织分离消化后停止，用无菌的 PBS 进行终止消化。

5、细胞过滤和洗涤
细胞悬液用 100μm 的筛网进行过滤，将细胞悬液过滤进入新的 15 ml 离心管中，用无菌 PBS 清洗筛网。离心管在 4℃，1200 g，离心 5 min，小心去除上清。沉淀细胞用 PBS 清洗一次；向细胞沉淀中加入适量的细胞培养液，轻轻吹打制成单细胞悬液，4℃，1200 g，离心 5 min。

二、肺癌类器官培养

6、试剂耗材的准备

实验前将人肺组织类器官分离培养液和 PBS 放置室温预热；将 Corning 24 孔低吸附培养提前放置 37℃ 预热；板将 BME放置 4℃ 冰箱融化过夜，与 BME 接触的枪头放置-20℃ 冷冻 1 小时。

7、种板
吸出上述步骤的上清液，将沉淀重悬在 BME 中，BME 置于冰上，防止凝固。BME 的用量取决于细胞沉淀的量，大约 10000 个细胞，接种在 50-60μL 的 BME2 中。将类器官和 BME2 的混合物滴在预热的 24 孔低吸附培养板底部，每滴 50μL，每孔 1 滴。

8、培养
将培养板放置于 37℃，CO2 培养箱，孵育 30 min，待胶体凝固后，将培养板取出，加入预热的人肺组织类器官分离培养液。

9、观察和更换培养液
2-3 天后根据类器官生长形态，更换人肺癌组织类器官培养液。每天观察类器官并拍照，了解初始类器官数量、增殖速度、形态、微生物污染情况等。