RNA Pulldown、DNA Pull-down

时间:2018-10-30浏览次数:1221

实验意义

核酸与蛋白质的互作是细胞功能的核心,包括蛋白质合成、mRNA组装等生命活动中重要的代谢过程,研究核酸与蛋白质的互作是研究生命科学的基本工具。


实验原理及步骤

RNA Pull-down:通过体外转录RNA并用生物素进行标记,然后与胞浆蛋白混合物共同孵育形成RNA-蛋白质复合物,然后用链霉亲和素标记的磁珠分离纯化该复合物(利用生物素与链霉亲和素的非共价亲和作用),洗脱后进行检测,如果检测蛋白为已知蛋白可通过WB进行鉴定,如果检测未知蛋白则可以结合质谱进行鉴定。流程为提取细胞胞浆蛋白样品液→体外转录合成生物素标记RNA→共孵育→磁珠纯化→洗脱得到互作蛋白→WB或质谱鉴定。

DNA Pull-down:通过合成标记有生物素的DNA片段,与细胞核蛋白混合物共同孵育形成DNA-蛋白质复合物,然后用链霉亲和素磁珠纯化,WB或者质谱进行检测鉴定。流程为提取核蛋白样品液→合成生物素标记DNA→共孵育→磁珠纯化→洗脱得到互作蛋白→WB或质谱鉴定。


结果展示

RNA Pull-down

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DNA Pull-down

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实验周期及交付标准

1. 实验周期:1-2个月

2. 交付标准:

RNA Pull-down:探针序列、X光片、实验报告(实验步骤、试剂、仪器等)

DNA Pull-down:探针序列、X光片、实验报告(实验步骤、试剂、仪器等)

 

需确认信息

1. 目的基因种属及ID号

2. 基因序列信息

3. 样本种属及类型

4. 样本数量

5. 分析要求

 

参考文献

[1] Chen R , Liu Y , Zhuang H , et al. Quantitative proteomics reveals that long non-coding RNA MALAT1 interacts with DBC1 to regulate p53 acetylation[J]. Nucleic Acids Research, 2017, 45(17):9947-9959.

[2] Tran D H , Shishido Y , Chung S P , et al. Identification of DNA-binding proteins that interact with the 5'-flanking region of the human D-amino acid oxidase gene by pull-down assay coupled with two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2015, 116:94-100.


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