组织单细胞制备

常见的组织类型：小鼠脾脏、肝脏、心脏、肺脏、脑组织、肿瘤组织、人肿瘤组织、皮肤组织……

传统组织处理方法：

机械法：网搓法、研磨法

适用样本类型：脾脏、淋巴结、胸腺

网搓法

1、将300 目尼龙网扎在无菌的小烧杯上；

2、把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完；

3、收集细胞悬液于离心管中， 1500rpm离心5min；

4、弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作用5min，加等体积的PBS中和后，1500rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤一次，再用PBS重悬，细胞计数后即可使用。

研磨法

1、先将组织剪成1-2mm大小组织块；

2、放入组织研磨器中，转动研棒，研至匀浆；

3、加入10ml生理盐水，冲洗研磨器；

4、收获细胞悬液，并经200目尼龙网过滤，1500rpm离心5min；

5、弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作用5min，加等体积的PBS中和后，1500rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤一次，再用PBS重悬，细胞计数后即可使用。

酶解法：
胰蛋白酶类、胶原酶、溶菌酶、弹性蛋白酶

适用样本类型：肝脏、肾脏、心脏、肺脏、脊髓、脑、肠道、皮肤、肿瘤等；

操作步骤：

1、先将组织剪成泥状。

2 、用胰蛋白酶或胶原酶消化组织块，胰蛋白酶适用千消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织。胰蛋白酌工作浓度一般为 0. 1 %—0 . 5 % 。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常用0 . 25 %胶原酶，胶原酌对组织中胶原蛋白类结构消化作用强，它仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。胶原酶常用浓度为 0 . 1—0 . 3ug / ml ，用大于组织量30—50 倍的胰蛋白酶液或胶原酶液在 37°C ，摇床上消化组织，消化时间的长短依组织类型而定，一般来说，胰蛋白酶油作用 20—60 min，胶原酶需1—4h左右，一般还会加入DNA核酸内切酶。

3、消化完毕后，将细胞悬液通过200目孔径尼龙网过滤，以除掉未充分消化的组织；

4、已过滤的细胞悬液经1500rpm离心5min后，弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作用5min，加等体积的PBS中和后，1500rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤一次，再用PBS重悬，细胞计数后即可使用。

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