hPSC肺泡类器官｜搭建人源肺纤维化体外药物筛选平台

Humanpluripotentstemcell‑derivedalveolarorganoidsformodelingpulmonaryfibrosisanddrugtesting

核心内容：建立一套人多能干细胞来源多细胞肺泡类器官体外肺纤维化建模体系，利用该模型筛选并验证MFG‑E8截短改造蛋白NP‑011的抗纤维化药效与作用机制，并在博莱霉素小鼠体内模型完成药效复现，为肺纤维化候选药物临床前评价提供人源体外平台。

1.基于hPSC分步定向分化，构建包含肺泡祖细胞、Ⅰ/Ⅱ型肺泡上皮、间充质细胞的多细胞人肺泡类器官（AOs）；

2.使用TGF‑β1诱导该类器官产生纤维化病理改变，建立体外人源肺纤维化模型；

3.利用该纤维化类器官评估改造蛋白NP‑011抗纤维化药效，解析作用分子机制；

4.在博莱霉素小鼠肺纤维化体内模型验证NP‑011药效，并与临床已上市药物吡非尼酮、尼达尼布做药效对标；

5.评估该肺泡类器官作为肺纤维化药物临床前筛选平台的可行性。

阶段1：hPSC维持与分步肺泡上皮分化：无饲养层、无异种体系培养hPSC，时序诱导分化获得远端肺泡谱系细胞；

阶段2：多细胞肺泡类器官（AOs）构建与细胞组分鉴定：分化第21天细胞消化为单细胞，强制聚集形成细胞团，成熟培养获得肺泡类器官，通过免疫荧光、qPCR完成细胞类型标志物鉴定；

阶段3：体外肺纤维化类器官模型建立与候选药物体外药效评价：TGF‑β1刺激类器官造纤维化模型，给予NP‑011干预，转录、蛋白、组织染色评估纤维化表型变化；补充人原代肺泡上皮、IPF患者成纤维细胞实验验证药物作用；

阶段4：小鼠体内肺纤维化模型验证药效与通路：博莱霉素诱导小鼠肺纤维化，设置不同给药途径、不同药物对照组，评估NP‑011体内抗纤维化效果、作用通路，与吡非尼酮、尼达尼布做药效对比；

阶段5：NP‑011作用机制补充（巨噬细胞‑胶原吞噬）：THP‑1诱导巨噬细胞体系，验证NP‑011促进巨噬细胞吞噬沉积胶原的作用；

完整验证链条

①类器官本身鉴定：免疫荧光+qPCR证明包含肺泡上皮+间充质多细胞组分；

②体外疾病模型有效性：TGF‑β1刺激重现PF分子与组织病理表型；

③药物体外药效多层验证：肺泡类器官模型、人原代肺泡上皮细胞、IPF患者来源成纤维细胞三层体外细胞体系验证NP‑011作用与通路；

④动物体内验证：博莱霉素小鼠肺纤维化模型，不同给药途径、剂量；与临床药物吡非尼酮、尼达尼布做头对头药效对比；转录组RNA‑seq+GSEA通路验证；

⑤补充机制验证：THP‑1巨噬细胞体系，证明NP‑011促进巨噬细胞吞噬胶原的机制。

模块1：hPSC维持、肺泡上皮分步分化、肺泡类器官(AOs)构建

1.操作周期/时间节点

①hPSC传代：每5天传代；

②肺泡分步分化：21天；

③类器官成熟培养：细胞团形成后继续培养6天得到成熟AOs。

2.核心试剂与关键材料

①hPSC培养：E8培养基、玻连蛋白包被板；

②消化试剂：胶原酶B(0.4 U/ml)、细胞解离缓冲液；

③类器官构建：AEC成熟培养基、ROCK抑制剂(10 μM)、Matrigel基质胶；96孔圆底板、低吸附6孔板。

3.核心操作步骤

①hPSC：80%汇合机械解离传代，37 ℃、5%CO₂培养；

②分化：hPSC接种密度1×10⁵cells/cm²，过夜后启动分步诱导；

③分化第21天，胶原酶B37 ℃消化2h，细胞解离缓冲液处理10min，70 μm筛过滤获得单细胞悬液；

④96孔圆底板每孔接种5×10⁴细胞，添加10 μMROCK抑制剂，1:15稀释Matrigel；450×g离心5 min，过夜聚集；

⑤将细胞团转移低吸附6孔板，成熟培养基继续培养6天，得到肺泡类器官。

4.注意事项：

①hPSC全程采用无异种、无血清、无饲养层培养条件；

②分化时间节点严格把控，在第21天收集细胞用于类器官组装；

③离心步骤保证细胞充分聚集，低吸附板避免类器官贴壁。

模块2：体外纤维化造模及药物体外干预分组方案

1.操作周期/时间节点：TGF‑β1造模处理72 h；NP‑011同步干预。

2.核心试剂：TGF‑β1，NP‑011（500 ng/ml）；人原代肺泡上皮细胞；IPF患者成纤维细胞；THP‑1单核细胞，PMA。

3.分组设置（肺泡类器官）

Con对照组；

TGF‑β1组（25 ng/ml）；

TGF‑β1+NP‑011（500 ng/ml）干预组。

4.补充体外细胞实验

①人pAECs：TGF‑β1（5 ng/ml）±NP‑011处理48 h；

②IPF患者成纤维细胞FMT实验：8个梯度NP‑011预处理，TGF‑β1诱导肌成纤维转化，高内涵HCA检测α‑SMA；

③THP‑1巨噬细胞分化：PMA200 ng/ml诱导48 h，撤PMA继续72 h得到巨噬细胞；胶原摄取实验NP‑011使用浓度15 μg/ml，孵育4 h。

5.注意事项：TGF‑β1处理时间严格72 h；NP‑011体外类器官工作浓度500 ng/ml。

模块3：体内博莱霉素小鼠肺纤维化模型及给药干预

1.操作周期/时间节点：气管滴注博莱霉素3 mg/kg；第5天（中度纤维化阶段）开始给药；给药后第3天处死取材。

2.试剂与动物：8‑10周雄性C57BL/6小鼠；博莱霉素3 mg/kg；NP‑011：80 μg/kg、160 μg/kg；吡非尼酮300 mg/kg；尼达尼布60 mg/kg；给药途径：静脉IV、气管内滴注IT。

3.分组：空白对照组、BLM模型组、BLM+NP‑011（IV/IT）、BLM+PFD、BLM+Nib。

4.注意事项：

①动物实验必须经IACUC伦理批准；

②造模后第5天才启动给药，模拟逆转已经建立的肺纤维化，而不是预防模型。

模块4：检测指标与技术手段

1.分子核酸水平：qPCR（纤维化基因Col1a1、Col1a2、α‑SMA、Vimentin等；内参GAPDH）；RNA‑Seq、GSEA基因集富集分析。

2.蛋白水平：Westernblot（p‑ERK、t‑ERK，p‑SMAD2/3，t‑SMAD2/3，Collagen、α‑SMA、纤连蛋白；内参Actin）；ELISA（BALFTGF‑β1）。

3.组织学：石蜡切片H&E、天狼星红、Masson三色染色；冰冻/石蜡切片免疫荧光（EPCAM、SFTPC、AQP5、T1α、Vimentin、α‑SMA、Collagen、F4/80）；共聚焦图像定量胶原阳性面积。

4.细胞功能：高内涵HCA分析FMT；流式细胞术巨噬细胞吞噬微球；胶原摄取指数CUI统计巨噬细胞吞噬FITC‑collagen。

1.NP‑011减轻肺泡类器官中TGF‑β1诱导的纤维化病变

A对照组与TGF‑β1（25ng/ml）诱导纤维化组肺泡类器官中，指定纤维化相关基因的qPCR检测结果。

B各组肺泡类器官切片的天狼星红染色与α‑SMA染色代表性图像。

C、D各组肺泡类器官的免疫印迹检测结果（C）及磷酸化ERK（p‑ERK）、磷酸化SMAD2/3（p‑SMAD2/3）与胶原的定量分析（D）。以肌动蛋白（Actin）作为内参。

E各组人原代肺泡上皮细胞中TGF‑β1、COL1A1与IL‑11的qPCR表达分析。

F人原代肺泡上皮细胞经TGF‑β1（25ng/ml）单独处理或TGF‑β1联合NP‑011（500ng/ml）处理72小时后，磷酸化ERK的免疫印迹分析。以肌动蛋白作为内参。

G肺纤维化患者来源成纤维细胞的成纤维转化（FMT）实验。上图为FMT实验整体流程，下图为高内涵分析（HCA）的定量数据。左侧纵轴蓝色散点表示NP‑011处理对TGF‑β1诱导的患者成纤维细胞α‑SMA表达的抑制百分比（PIN）；右侧纵轴橙色散点表示NP‑011处理后患者成纤维细胞的存活比例。

结论：TGF‑β1可在hPSC‑AOs成功诱导纤维化；NP‑011主要抑制ERK磷酸化，对SMAD2/3抑制弱；NP‑011可抑制IPF患者成纤维细胞FMT；该类器官可用于抗纤维化药物体外药效筛选。

2.NP‑011通过抑制ERK信号通路逆转已形成的肺纤维化

AqPCR检测各组小鼠肺组织中Col1a1与Mmp2的mRNA水平。

B各组小鼠肺组织切片的苏木精‑伊红（H&E）染色、马松三色染色、天狼星红染色、胶原染色与α‑SMA染色代表性图像。

C、D各组小鼠全肺组织匀浆的免疫印迹检测结果（C）及磷酸化ERK、磷酸化SMAD2/3、α‑SMA与胶原的定量分析（D）。以肌动蛋白作为内参。

E两组GSEA结果显示，肺纤维化模型中NP‑011给药组较博莱霉素处理组的非经典ERK信号通路基因集受到显著抑制。

结论：静脉、气管滴注两种给药途径NP‑011均可逆转小鼠已建立肺纤维化；药效依赖ERK通路抑制，不显著抑制SMAD2/3磷酸化；hPSC类器官模型药效预测与体内动物结果一致。

3.NP‑011、吡非尼酮与尼达尼布对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的治疗效果对比

A各组处理小鼠肺组织切片的H&E染色、马松三色染色与天狼星红染色代表性图像，展示三种药物对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织中胶原与α‑SMA表达的影响。

BCol1a1表达的qPCR分析。

C共聚焦显微镜检测的胶原阳性面积定量结果。

D对照组、博莱霉素造模组及三种药物治疗组小鼠全肺组织的免疫印迹检测，检测指标包括磷酸化ERK、胶原、α‑SMA，以肌动蛋白作为内参。

E磷酸化ERK、胶原与α‑SMA的定量分析。

结论：NP‑011体内抗纤维化药效与已上市药物吡非尼酮、尼达尼布相当；三者均抑制非经典ERK信号通路。

4.NP‑011促进肺组织中巨噬细胞介导的胶原摄取

A佛波酯诱导单核细胞分化为巨噬细胞的整体实验流程示意图。

B分化后巨噬细胞（上图）及分化巨噬细胞摄取FITC标记微球（下图）的代表性图像。比例尺：10μm。

C流式细胞术结果显示分化巨噬细胞可摄取FITC标记微球。

D分化巨噬细胞在有无NP‑011条件下进行纤维化胶原摄取实验的示意图。

E对照组与NP‑011处理组的相对胶原摄取指数（CUI）定量分析。柱形图表示三次独立重复实验的平均值±标准差。

F博莱霉素诱导肺纤维化模型与NP‑011给药模型小鼠肺组织中，小鼠胶原与小鼠F4/80的免疫染色代表性图像。

G肺组织中胶原阳性、F4/80阳性双阳性细胞的定量结果。在每张染色切片的3个不重复视野中计数阳性细胞。

结论：NP‑011除抑制间质转化外，还能够促进巨噬细胞吞噬清除沉积胶原，是NP‑011双重抗纤维化机制之一。

1.构建多细胞肺泡类器官用于肺纤维化药效评价：既往hPSC肺泡类器官多用于发育、遗传病研究；本模型同时包含肺泡上皮+内源性间充质细胞，TGF‑β1刺激后可以重现胶原沉积、上皮‑间充质转化肺纤维化核心病理，实现人源体外PF药物评价，解决传统模型物种差异问题。

2.改造MFG‑E8得到截短蛋白NP‑011：截除MFG‑E8的C2结构域；一方面规避C2结构域medin淀粉样片段带来潜在AD、糖尿病风险；另一方面消除C2糖基化，提升蛋白和沉积胶原结合能力；明确NP‑011主要靶向非经典ERK信号通路，而非SMAD通路发挥抗纤维化效应。

3.揭示NP‑011双重抗纤维化机制：除抑制上皮/成纤维细胞的间质转化以外，还可以促进巨噬细胞吞噬清除沉积胶原；区别于现有抗纤维化药物仅抑制纤维化进展，同时兼顾促进已有纤维化病灶的胶原清除。

参考文献：Human pluripotent stem cell-derived alveolar organoids for modeling pulmonary fibrosis and drug testing