多重免疫荧光总串色？一篇讲清TSA 染色全流程

石蜡切片做多重免疫荧光，难点通常不在“多染几个颜色”，而在于抗体之间是否串色、重复抗原修复会不会损伤表位，以及不同通道的信号强度能不能拉开。

如果只做2个靶标，而且两支一抗来自不同物种，常规间接免疫荧光就可以完成。做到3～4个靶标，或者几支一抗来自同一物种时，TSA（Tyramide Signal Amplification，酪胺信号放大）序贯染色更方便。本文按2～4个目标蛋白，另加DAPI核染的FFPE切片方案梳理操作流程。

正式做多色前，每支抗体先单独跑一次FFPE免疫荧光或IHC，确认定位、背景和工作浓度。TSA具有信号放大作用，多重染色时的一抗浓度往往不能直接照搬普通IHC条件，通常需要重新滴定。

染色顺序也会影响结果。每完成一个颜色后，都要经过一次热处理去除上一轮一抗和HRP检测体系，前面的抗原会经历更多轮加热。对热处理比较敏感、表达量较低的靶标，可以优先放在前面；表达稳定、丰度较高的标志物放在后面更容易控制。

荧光搭配时，低表达靶标尽量使用亮度较高的荧光通道，高表达靶标可以分配给相对弱一些的通道。FFPE组织本身存在自发荧光，弱表达靶标如果落在背景较高的波段，信噪比会明显下降。

石蜡切片常用3～5 μm厚度，使用防脱载玻片。切片烤片后进行二甲苯脱蜡，再经过100%、95%等梯度乙醇复水至蒸馏水。

抗原修复可根据抗体选择柠檬酸缓冲液pH 6.0或EDTA类缓冲液pH 8～9。常见起始条件为95～100℃加热约15～20 min，随后自然冷却。不同抗原对修复液和加热时间的耐受差异较大，如果已有成熟IHC条件的抗体可以优先沿用其修复体系。

切片冷却后进入后续封闭步骤。TSA体系依赖HRP催化，需要先封闭组织内源性过氧化物酶，常用3% H₂O₂处理约10 min，再进行蛋白封闭。

封闭完成后加入第1支一抗，常在室温孵育30～60 min或4℃过夜。洗片后加入与一抗物种匹配的HRP标记二抗或HRP polymer，孵育后再次清洗。随后加入第1种TSA荧光试剂，反应时间约5～10 min。

HRP催化TSA形成活性中间体，并将荧光基团共价沉积在抗原周围的蛋白上。因此后面即使通过加热去除一抗和二抗，已经沉积的荧光信号仍然能够保留，这也是TSA可以连续进行多轮染色的基础。

TSA浓度并不是越高越好。信号过强时容易扩大染色范围、增加背景，低表达和高表达靶标通常需要分别优化TSA浓度。

图1丨TSA 酪胺信号放大核心原理

第1轮TSA完成后，需要去除已经结合在切片上的一抗和HRP检测体系。将切片重新放入柠檬酸缓冲液中加热，在接近沸点后保持亚沸状态约10 min，再冷却至室温。

之后按照同样流程继续：

封闭 → 第2支一抗 → HRP检测 → 第2种TSA荧光 → 抗体剥离

需要3色、4色时继续重复相同过程。最后一轮TSA完成后不再进行抗体剥离，直接进入DAPI核染和封片。

TSA序贯染色允许多支一抗来自同一物种，因为上一轮抗体会在进入下一轮前被去除，在正式实验前最好用剥离对照确认上一轮抗体没有残留。

图2丨TSA 多轮序贯染色循环流程

当全部目标蛋白染色完成后，用DAPI进行细胞核复染，随后使用抗荧光淬灭封片剂封片。

拍照时，各组使用相同曝光、增益和激光功率。普通荧光显微镜做3～4色时，需要提前检查不同荧光通道的发射光谱，减少bleed-through；使用多光谱成像系统时，还可以通过光谱拆分降低自发荧光和通道重叠的影响。

图3丨石蜡切片 4 色多重免疫荧光成像结果

1. 单染对照

每支抗体先单独染色，确认定位和信号强度。后续多重染色出现异常时，可以判断问题来自抗体本身还是组合后的干扰。

2. 无一抗对照

省略一抗，其余HRP和TSA步骤保持不变，用于观察非特异性背景和TSA体系本身的信号。

3. 抗体剥离对照

完成一轮染色并进行热剥离后，不加下一轮一抗，直接进入HRP检测。如果仍出现上一轮对应信号，需要检查抗体是否去除充分。

4. 未染组织对照

FFPE组织本身可能存在明显自发荧光，肝脏、肾脏以及含较多红细胞、胶原或脂褐素的组织尤其明显。保留一张未染切片，有助于判断背景来自组织本身还是抗体体系。

1. 第一轮很好，后面的颜色越来越弱

多轮热处理可能造成部分表位逐渐丢失。可以调整抗体顺序，把热敏感或低表达靶标提前，同时重新检查抗原修复条件。

2. 所有通道背景都很高

需要检查一抗浓度、TSA浓度、内源性过氧化物酶封闭以及洗涤条件。FFPE组织自发荧光明显时，可以结合自发荧光淬灭或光谱拆分处理。

3. 同物种抗体之间出现串色

常见原因是上一轮抗体或HRP没有去除干净。可以先做剥离对照，再调整加热时间和剥离条件。

4. 染到第三、四轮开始掉片

重复高温修复对组织附着要求较高。切片使用防脱载玻片，烤片和组织固定状态也要保持稳定。脱蜡不充分、组织过厚或反复高温处理都可能增加掉片风险。

5. 有信号，但不同颜色强弱差异很大

先看靶标本身表达量，再调整抗体浓度和荧光通道搭配。低表达蛋白分配较亮的荧光，高表达蛋白降低TSA浓度或使用相对弱的通道，通常比单纯提高所有通道曝光更合适。

图4丨免疫荧光正常染色与高背景对比

石蜡切片2～4色多重免疫荧光可以采用普通间接IF或TSA序贯染色。两种不同物种一抗的双染相对简单；靶标数量增加、存在同物种一抗或低表达蛋白时，TSA更适合连续扩展。

正式组合前先完成单染条件确认，再确定抗体顺序、TSA强度和荧光搭配。多轮染色过程中重点关注表位耐热性、抗体剥离是否充分以及FFPE组织自发荧光，基本覆盖了2～4色多重免疫荧光最常见的问题。