胰腺癌患者来源类器官方法学学习！

1.标本采集类型与操作方式

研究适配两类临床场景的标本来源，同时设计配对标本用于纵向研究：

①细针类标本（FNA/FNB）：针对接受内镜或影像引导下穿刺的患者，在临床诊断穿刺基础上额外增加1次穿刺采集研究组织；分为细针抽吸（FNA）与细针核心活检（FNB）两种，适配术前新辅助评估场景。

②手术切除标本：针对接受肿瘤切除术的患者，术后即刻从新鲜标本中取多余的存活肿瘤组织，避开坏死、纤维化区域。

2.标本转运与前处理流程

①采集后即刻将新鲜组织浸没于专用培养基中进行活性稳定；

②全程冰上低温转运，送至实验室；

③核心时限要求：所有标本必须在采集后24小时内完成解离与接种，保证细胞活性。

3.采集环节核心注意事项

①需完整记录患者放化疗暴露史，该因素是后续类器官构建成功率的最强影响因子；

②操作全程避免组织干燥、常温长时间放置或反复机械损伤；

③活检标本组织量极少，需精准控制后续消化强度，避免细胞过度损耗。

1.类器官构建与培养的标准操作流程

（1）组织解离处理

根据标本类型采用差异化解离策略，平衡细胞产量与活性：

手术切除标本：

①无菌条件下将组织剪碎至1mm³左右的细小组织块；

②加入消化培养基：含1mg/mLXI型胶原酶、10μg/mLI型脱氧核糖核酸酶、10.5μMY-27632的人完全培养基；

③37℃温和振荡孵育，最长不超过60分钟；

④辅以机械吹打进一步解离组织；

⑤必要时进行红细胞裂解，随后离心洗涤2次收集细胞沉淀。

FNA/FNB活检标本：

①直接通过机械吹打散解细胞团；

②若组织块偏大，补充上述消化培养基孵育，最长不超过60分钟；

③离心洗涤步骤同手术标本。

（2）接种与原代培养

①将解离后的细胞重悬于预冷的基质胶（Matrigel）中，按标准密度接种于培养板；

②待基质胶凝固后，加入人完全培养体系，配方为：

以AdvancedDMEM/F12为基础，添加10mMHEPES、1×Glutamax、1×Primocin、500nMA83-01、50ng/mLhEGF、100ng/mLhNoggin、100ng/mLhFGF10、0.01μM人胃泌素I、1.25mMN-乙酰半胱氨酸、10mM烟酰胺、1×B27补充剂、10%R-spondin1条件培养基、50%Afamin/Wnt3A条件培养基。

③每2~3天更换一次培养基，镜下观察类器官形态与生长状态。

（3）传代扩增

①待类器官生长至融合度70%~80%时进行传代：采用细胞回收液将类器官从基质胶中洗脱；

②加入TrypLE消化液，37℃温和孵育5~10分钟，结合机械吹打，将类器官解离为小细胞团与单细胞混合悬液；

③离心洗涤后，按1:2~1:3的比例重新与基质胶混合接种，继续培养。

（4）建系判定与质量控制

①建系成功标准：经连续≥3次传代后，类器官可持续稳定生长、形态均一、扩增速率稳定。

②传代分级：传代次数＜5定义为低传代类器官，≥5定义为高传代类器官；标准药物筛选采用≥5代的稳定建系样本。

③质量控制：所有类器官系常规进行支原体检测，排除微生物污染。

④命名规则：手术切除来源命名为hT+编号，细针活检来源命名为hF+编号。

2.类器官药物敏感性检测体系

（1）标准药物筛选方案

①检测药物面板：覆盖胰腺癌一线标准化疗药物共5种：吉西他滨、紫杉醇、SN-38（伊立替康体内活性代谢产物）、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂。

②浓度梯度设置：

吉西他滨、紫杉醇、SN-38：1e-5μM~2.0μM，共9个浓度梯度；

5-氟尿嘧啶、奥沙利铂：1e-4μM~99μM，共9个浓度梯度。

③实验体系：每个浓度设置3个复孔，同步设置溶剂对照组（DMSO）；药物处理后连续培养5天，采用CellTiter-Glo发光法检测细胞活力。

④数据处理与应答判定：

绘制剂量-反应曲线，计算单药曲线下面积（AUC），对应图5A的各药物反应曲线；标准化AUC：将单药AUC除以该药物浓度范围内的最大AUC，消除药物本身浓度范围差异，实现跨样本、跨批次可比；

三分位分层法：基于75例PDO的大样本生物库数据，按标准化AUC的z值分为三分位：下三分位定义为敏感，上三分位定义为耐药，中间为中等敏感，对应图B小提琴图的分层逻辑；

⑤联合方案评分：将单药标准化AUC相加得到AUC总分，对应临床联合方案：GnP方案（吉西他滨+白蛋白紫杉醇）、FFX方案（5-FU+奥沙利铂+SN-38），总分越高提示对该方案耐药性越强。

（2）快速药物筛选方案（对应图7）

针对新辅助化疗的临床时间窗限制，开发低传代快速检测流程：

①标本要求：选择肿瘤细胞密度高、基质/坏死组织少的标本，无需等待长期建系；

②周期表现：类器官平均培养10天即可启动筛选，最短仅需2天；联合5天药物检测，从组织接收到出具数据平均仅15天，最快可在7天内获得结果（对应图A、B）；

③结果稳定性：连续传代的重复筛选可获得高度一致的剂量-反应曲线，证明快速筛选结果可靠（对应图C、D）；

④化疗后标本适配性：新辅助化疗后标本也可进行快速筛选，仅需适当延长培养时间，23天内可获得完整数据（对应图E、F）。

3.关键操作注意事项

①放疗暴露标本建系难度极高，优先选择化疗初治或仅化疗暴露的标本；若必须使用，需评估放疗后间隔时间；

②消化时间需根据标本大小、质地灵活调整，过度消化会显著降低细胞活率与建系成功率；

③基质胶浓度、接种细胞密度需严格标准化，是保证剂量反应曲线稳定、批间可比的核心；

④快速筛选对标本质量要求高，肿瘤细胞占比低于30%的标本无法实现快速检测。

参考文献：Pancreatic Cancer Patient-Derived Organoids Can Predict Response to Neoadjuvant Chemotherapy