小鼠原位肝癌模型构建指南｜高死亡率 / 成瘤不均怎么解决？

小鼠原位肝癌模型是将肿瘤细胞或肿瘤组织接种到肝脏，使肿瘤直接在肝脏微环境中生长。相比皮下移植瘤，原位模型更适合观察肿瘤局部生长、肝内侵袭、转移及药物作用。

这个模型最容易出问题的环节集中在肝脏暴露、进针位置、细胞注射和术后恢复。肝脏出血、细胞外漏和接种条件不一致，都会造成死亡率升高、腹腔异位成瘤和组内肿瘤差异。

H22属于小鼠来源肝癌细胞，常用于BALB/c等同系小鼠，适合肿瘤免疫、药效和微环境研究；HepG2属于人源肝癌细胞，通常使用BALB/c nude、NOD/SCID、NSG等免疫缺陷小鼠，更适合人源靶点和药物评价。

原位移植常用肝内细胞悬液注射和肿瘤组织块植入两种方式。前者操作快、接种细胞量容易控制；后者接种组织量更容易统一，但需要提前建立供体瘤。本文重点围绕肝内细胞悬液注射法。

选择状态稳定、处于对数生长期的肿瘤细胞，接种前去除残余培养液和消化液，调整细胞浓度并检查活率，同时充分吹散细胞团。细胞悬液现配现用，批量手术过程中定期轻柔混匀，减少细胞沉降造成的接种量差异。

HepG2等贴壁细胞可根据实验设计与Matrigel等基质混合，提高接种液黏度。含Matrigel体系全程保持低温，装针后尽快完成接种。

术前准备麻醉设备、保温装置、无菌手术器械、微量注射器、29～31 G细针、无菌棉签、纱布、缝合材料及止血材料。全部准备完成后再开始麻醉，减少手术等待时间。

Step 1：麻醉、备皮与消毒

完成麻醉后将小鼠仰卧固定，腹部备皮并进行术区消毒。麻醉、开腹和术后恢复阶段持续保温，并根据呼吸、反射等状态调整麻醉深度。

Step 2：开腹暴露肝脏

在上腹部做小切口，依次打开皮肤和腹壁，用湿润无菌棉签轻轻暴露目标肝叶。避免用镊子直接夹持肝组织，以减少肝包膜破裂和出血。左叶或左外侧叶位置较容易暴露，可固定作为同批实验的接种位置。

Step 3：稳定肝叶

用湿润棉签从肝叶下方轻轻托住，使待注射区域保持稳定，同时保持组织湿润。调整肝叶时以轻推为主，减少反复牵拉。

Step 4：肝包膜下进针

针头以较低角度刺入肝包膜，并沿肝表面进入浅层肝实质。常用细针低角度进针，部分方案可从约2～3 mm浅层进针作为起始条件，再根据动物体型和肝叶厚度调整。

针尖太浅容易直接穿出，太深则容易造成肝实质损伤和出血。同一批实验应固定目标肝叶、进针方向和大致深度。

Step 5：缓慢注入细胞

稳定针筒后缓慢推注细胞悬液。原位肝内注射通常采用较小体积，20 μL左右可作为常见起始条件，具体细胞数和体积根据细胞系成瘤能力通过预实验确定。

正常情况下，接种区域可见轻微局部隆起。如果针孔持续返液、肝表面出现明显液滴或腹腔内出现接种液，说明已经发生外漏，应立即停止继续推注。

Step 6：退针与针孔处理

注射完成后保持针尖短暂停留，再沿原方向缓慢退出，同时用无菌棉签轻压针孔。待局部无明显返流和活动性出血后再移开棉签。

肝内注射容易在这一步发生细胞外漏，因此不要注射结束后立即快速拔针。

Step 7：肝脏复位与关腹

确认肝表面无持续出血和液体返流后，将肝叶轻轻复位，避免组织扭转或受压。随后依次关闭腹壁和皮肤，完成切口处理。

Step 8：术后恢复

术后将小鼠置于保温环境中恢复，观察呼吸、活动、切口和出血情况，并记录后续体重、进食饮水及一般状态。按照动物伦理方案完成镇痛和术后护理。

4.1 术中术后高死亡率成因与优化

麻醉意外

成因：麻醉过深、麻醉时间过长或低体温可造成呼吸抑制和苏醒延迟。

优化：根据体重和麻醉方式控制麻醉深度。异氟烷便于术中调节、恢复较快，小鼠常规麻醉前无需长时间禁食；手术全程做好保温。

术中腹腔出血

成因：进针过深、反复穿刺、牵拉肝叶或退针后压迫不足。

优化：细针低角度进入浅层肝实质，尽量一次完成注射；退针后立即压迫针孔，确认无活动性出血后再关腹。

腹腔异位种植

成因：注射体积过大、推注过快或退针时细胞悬液返流。

优化：控制接种体积，缓慢推注并短暂停针；退针后立即压迫针孔。出现明显外漏的动物根据预设纳排标准处理。

术后感染

成因：器械、术野或缝合过程污染。

优化：器械灭菌、术区消毒和无菌操作贯穿整个手术过程。规范无菌存活手术不常规依赖预防性抗生素。

肿瘤负荷过大

成因：接种量过高或观察周期过长，可导致肿瘤快速生长、肝功能受损和腹水。

优化：正式实验前通过预实验确定接种量和观察周期，不同细胞系分别确定条件。

4.2 成瘤不均与成瘤率低成因与优化

细胞剂量不均

成因：细胞沉降、团聚或注射器残留气泡。

优化：批量注射过程中定期轻柔混匀，使用微量注射器控制体积并排尽气泡。

注射位置差异

成因：肝叶、进针深度和注射方向不一致。

优化：同一实验固定目标肝叶、穿刺方向和大致深度。

细胞状态差异

成因：消化过度、细胞团聚或悬液放置时间过长。

优化：使用状态稳定的对数生长期细胞，接种前检查活率并保持不同批次条件一致，细胞悬液现配现用。

动物个体差异

成因：品系、性别、周龄和体重差异会增加组内变异。

优化：同批实验统一动物来源、品系、性别和周龄，并控制体重范围。

原位接种后的成瘤速度受细胞系和接种量影响，H22等模型常可在1～2周进入明显生长期，具体时间以实际模型为准。

1.活体成像评价：

使用Luciferase标记细胞后，可动态监测原位肿瘤负荷及转移。不同时间点保持底物剂量、麻醉和成像参数一致。

2.血清学评价：

检测ALT、AST等指标评价肿瘤相关肝损伤。AFP只用于本身稳定表达AFP的模型，不作为所有原位肝癌模型的统一成模标准。

3.大体解剖评价：

终点完整取出肝脏，记录肿瘤位置、结节数量、大小及重量。边界相对规则的肿瘤可用V＝长径×短径²/2估算体积；形态不规则时结合肿瘤重量或影像学数据评价。

4.组织病理学评价：

HE染色观察肿瘤结构、肝实质浸润、坏死及血管侵犯；Ki-67评价增殖，CD31评价血管生成。AFP、GPC3、HepPar-1及人源特异性标志物根据细胞来源和研究目的选择。

小鼠原位肝癌模型的稳定性主要取决于细胞状态、肝叶暴露、进针位置、针孔返流、术中出血和术后恢复。死亡率高时重点检查麻醉、低体温和出血；成瘤差异大时优先排查细胞状态、实际接种量和注射位置；出现腹腔多发结节时，应首先排除细胞外漏造成的异位成瘤。