从原代构建到多组学验证，肾小管类器官慢病毒工程化标准操作Protocol！

本方案完整阐述了患者来源肾类器官（肾小管类器官）的构建，以及慢病毒介导的目的基因稳定整合与表达流程。转导后的类器官可通过多种分子、细胞实验开展多维度表征。

该工作流可系统研究患者来源类器官中基因修饰引发的表型与转录组改变，为肿瘤生物学研究、治疗靶点筛选提供生理相关的可靠模型。

本部分介绍利用原代组织（肿瘤组织和/或正常组织）构建人肾小管类器官的操作步骤。

原代组织构建人肾小管类器官

（A）切碎前的切除原代组织；（B）胶原酶消化后得到的细胞沉淀示例；（C）接种于BME中的消化后组织；（D、E）接种后1周（D）及第一次传代后（E）典型肾小管类器官的明场图像。

1.将组织收集于装有40mLAdvDF+++培养基的50mL离心管中。

2.将组织置于10cm玻璃培养皿中，用两把手术刀将其切碎至约1mm³大小（图A）。

3.将切碎的组织转移至15mL离心管中；用5mLAdvDF+++培养基冲洗培养皿以收集全部组织，冲洗液转移至同一离心管。

4.4℃条件下250×g离心5分钟，弃上清。

5.胶原酶消化组织：

a.向沉淀中加入5mL预热至37℃的胶原酶溶液。

b.离心管置于预热振荡培养箱中，37℃、250rpm孵育30-45分钟。

c.孵育15分钟后，观察悬液是否均一、大部分组织块是否已消散。

关键注意：孵育时间不得超过60分钟上限

6.观察到组织解离后，向管中加入10mLAdvDF+++培养基，颠倒离心管10次混匀。

7.4℃、250×g离心5分钟，弃上清（图B）。

8.可选步骤：若仍可见组织块，加入5mLAdvDF+++培养基，将悬液经100μm尼龙细胞筛过滤后，4℃、250×g离心5分钟，弃上清。

9.若沉淀呈红色（含红细胞），加入1mL红细胞裂解液，轻轻振荡（切勿吹打）；室温孵育5分钟后加入10mLAdvDF+++培养基，4℃、250×g离心5分钟，弃上清。

10.基底膜提取物（BME）重悬细胞并接种：

a.轻柔吹打重悬沉淀，避免产生气泡。

b.按沉淀体积的70%-75%加入BME。

c.用200μL移液器轻柔重悬，向预热的多孔培养板中滴加20μL液滴：24孔板每孔3滴，12孔板每孔6滴，6孔板每孔10滴。

关键注意：BME需提前4℃解冻12-16小时，操作全程置于4℃以保持液态

关键注意：多孔培养板需提前37℃预热12-16小时，确保液滴正常凝固

注：BME用量可根据消化组织量调整。参考标准：1mm³活性组织消化所得细胞，通常可接种3-6个20μL液滴。

11.小心将培养板倒置，置于37℃、5%CO₂培养箱中静置约20分钟，使液滴凝固。

12.根据培养板规格加入预热（37℃）的完全培养基：24孔板每孔500μL，12孔板每孔1mL，6孔板每孔2.5mL（图C）。

13.37℃、5%CO₂培养箱中培养，每3-4天更换一次培养基。

构建后质量鉴定

健康肾来源的肾小管类器官会形成单层极化上皮构成的球形囊状结构，随培养时间逐渐重塑为折叠的管状结构。

可通过免疫荧光标记验证：

• 肾小管上皮身份：PAX8

• 细胞极性：ITGA6、ZO-1、F-肌动蛋白

• 节段特异性标记：近端小管（VIL1）、集合管（AQP3）

本部分介绍已建立肾小管类细胞系的传代方法，基本原理可普遍适用于各类肿瘤/正常组织来源的类器官模型。

肾小管类器官培养物传代

（A）待传代的典型肾小管类器官明场图像；（B）套叠吸头机械解离操作示意；（C）类器官部分解离状态；（D）完全解离后的单细胞悬液。

注：扩增速率因组织/肿瘤类型而异。通常肾小管类器官每7天可按1:2-1:3比例传代，推荐接种密度为1000-2500个细胞/μLBME。待传代类器官示例见图A。

1.用1000μL带滤芯吸头，利用孔内培养基反复吹打散液滴与类器官；用吸头刮擦孔底，收集所有贴壁细胞，全部内容物转移至15mL离心管。

2.加入10mL预冷AdvDF+++培养基，4℃、250×g离心5分钟，弃上清。

3.向沉淀中加入添加Rho激酶抑制剂（10μM）的TrypLE消化液；每100μL含类器官的BME对应加入500μLTrypLE，37℃孵育5分钟。

4.机械解离类器官：将无滤芯10μL吸头套在带滤芯1000μL吸头上，反复吹打20次（图B）。

关键注意：镜下观察若仍有大量完整类器官，需重复37℃TrypLE孵育5分钟+机械解离步骤（图2C、2D）

5.BME重悬细胞沉淀并接种：

a.轻柔吹打重悬沉淀，避免产生气泡。

b.按沉淀体积的70%-75%加入BME。

c.用200μL移液器轻柔重悬，向预热多孔板滴加20μL液滴：24孔板每孔3滴，12孔板每孔6滴，6孔板每孔10滴。

6.小心倒置培养板，37℃、5%CO₂培养箱中静置约20分钟使液滴凝固。

7.加入预热完全培养基（24孔板500μL/孔、12孔板1mL/孔、6孔板2.5mL/孔），镜下观察类器官状态。

8.37℃、5%CO₂培养箱中培养，每3-4天换液。

本部分介绍HEK293T细胞制备慢病毒颗粒，以及旋转感染法转导肾小管类器官的操作。

1.接种HEK293T细胞（转染第1天）

a.吸弃15cm培养皿中HEK293T细胞的培养基。

b.沿皿壁轻轻加入10mLDPBS，轻柔晃动洗涤贴壁细胞。

c.弃DPBS，加入2mL预热（37℃）TrypLE消化液。

d.37℃孵育2-3分钟。

e.明场镜下观察细胞脱壁后，加入10mL预热培养基终止消化，充分重悬。

f.按1:3比例分至3个新15cm培养皿，每皿加4mL细胞悬液。

g.每皿补16mL培养基，轻柔晃动使细胞均匀分布。

h.37℃、5%CO₂培养至次日（转染当天汇合度约75%）。

注：每次病毒制备对应1个15cm皿。若构建物无荧光标记，建议额外接种对照板，转染荧光蛋白质粒以评估转染效率。

2.HEK293T细胞转染（转染第2天）

注：细胞汇合度需达70%-80%以保证转染效率。

a.按前述配方配制OptiMEM-DNA混合液（每15cm皿用量）。

b.低速涡旋混匀2秒（Vortex-Genie2调至3档）。

c.配制OptiMEM-PEI混合液：2mLOptiMEM+315μLPEI。

d.低速涡旋混匀2秒。

e.室温孵育OptiMEM-PEI混合液5分钟；逐滴加入DNA混合液中，制成PEI/DNA复合物。

f.低速涡旋混匀2秒。

g.室温孵育PEI/DNA复合物30分钟。

h.复合物逐滴加入细胞培养皿中，轻柔晃动混匀。

i.37℃、5%CO₂培养箱中培养。

j.转染后6-8小时更换新鲜培养基。

3.病毒上清收集（转染第3-4天）

a.转染后48小时收集培养上清，经0.45μm无菌滤器过滤至50mL离心管。

b.可选：转染后72小时二次收集上清，合并以提高病毒滴度。

24.超速离心浓缩慢病毒

a.过滤后的病毒上清转移至超速离心管，平衡重量。

b.4℃、25000rpm（约80000×g）超速离心2小时。

c.小心弃上清，避免触碰病毒沉淀。

d.用100-200μLAdvDF+++培养基重悬沉淀，4℃孵育12-16小时使病毒充分溶解。

e.分装后-80℃保存，避免反复冻融。

4.肾小管类器官转导

a.转导前1天按前述方法传代类器官，接种于24孔板，确保转导当天细胞处于活跃增殖期。

b.吸弃培养基，加入含慢病毒颗粒与8μg/mLPolybrene的完全培养基，总体积250μL。

c.培养板置于离心机中，32℃、800×g离心30分钟（旋转感染）。

d.离心后放回37℃、5%CO₂培养箱培养。

e.转导后8-24小时更换新鲜培养基。

26.药物筛选稳定细胞

a.转导后48-72小时加入对应筛选抗生素，浓度参考前述表格。

b.每3-4天更换含药培养基，筛选持续1-2周，直至未转导对照组细胞全部死亡。

c.筛选完成后可扩大培养或用于下游实验。

肾小管类器官固定与石蜡包埋工作流程

（A）多聚甲醛固定类器官；（B）液态石蜡中洗涤类器官；（C）玻璃吸管转移类器官至金属模具；（D）向模具中加石蜡；（E）包埋盒加盖并加满石蜡；（F）石蜡凝固后包埋完成的样本。

1.FFPE包埋

①类器官收集与固定：

a.按步骤13-16收集并解离类器官。

b.DPBS洗涤细胞2次，200×g离心5分钟，弃上清。

关键注意：此转速离心避免细胞聚集

c.加入5mL4%多聚甲醛（PFA），重悬后室温固定15-30分钟。

d.4℃、200×g离心5分钟，弃上清。

e.加入5mL1×PBS，室温孵育15分钟。

f.4℃、200×g离心5分钟，弃上清。

g.重复e-f两次。

h.加入5mL70%乙醇，转移至平底玻璃样品瓶，4℃孵育12-16小时。

注：样本可在70%乙醇中4℃保存数周。

关键注意：垂直放置孵育，避免类器官黏附管壁造成样本损失。

②梯度乙醇脱水：

a.小心吸去70%乙醇，加入2mL乙醇配制的纯伊红，室温孵育10分钟。

注：伊红染色便于石蜡包埋后定位类器官，脱蜡时会被去除。

关键注意：吸液前确保类器官已沉降至管底

b.吸去伊红，加入2mL100%乙醇，室温孵育30分钟。

c.重复步骤b两次。

d.吸去乙醇，加入2mL正丁醇，室温孵育30分钟。

e.重复步骤d两次。

2.石蜡包埋：

a.小心吸去正丁醇。

b.加热石蜡包埋机中，向样品瓶加入液态石蜡，60℃加热块孵育30分钟（图4B），吸弃石蜡。

关键注意：加入石蜡时动作缓慢

c.重复浸蜡2次，最后一次保留25%体积的石蜡。

d.预热玻璃吸管与金属模具（60-65℃），用预热吸管将类器官转移至金属模具（图C）。

关键注意：操作迅速，避免石蜡在吸管中凝固；替代方案见问题排查4

e.将类器官调整至模具中央。

f.模具置于冷板冷却10秒。

g.模具中加满液态石蜡（图D）。

h.塑料包埋盒盖在模具上方。

i.向包埋盒中加满石蜡（图E）。

j.冷板放置至少2小时，确保石蜡完全凝固。

k.取下金属模具，石蜡块室温保存（图F）。

3.组织学与免疫组化染色

肾小管类器官组织学表征的H&E染色

（A）FFPE蜡块切片操作；（B）带石蜡切片的载玻片；（C）肾小管类器官H&E染色结果（*为残留基底膜提取物BME）。

注：所有孵育步骤在塑料染色缸中进行，每步更换染色缸。

①石蜡切片：

a.石蜡块冷板冷却10分钟后再切片。

b.切片机切取4μm厚切片，预冷镊子转移至42℃温水浴展片。

c.载玻片捞取展平的切片。

d.37℃烘干12-16小时去除水分。

e.60℃烤片1小时。

②脱蜡与梯度复水：

a.二甲苯孵育5分钟，重复2次。

b.100%乙醇孵育1分钟，重复2次。

c.96%乙醇孵育1分钟，重复2次。

d.80%乙醇孵育1分钟，重复2次。

e.70%乙醇孵育1分钟，重复2次。

f.50%乙醇孵育1分钟，重复2次。

③H&E染色：

a.苏木精染液孵育2分钟，自来水冲洗10分钟返蓝。

b.自来水孵育5分钟。

c.伊红染液孵育30秒。

d.梯度脱水至二甲苯透明：

i.80%乙醇1分钟；ii.95%乙醇1分钟×2次；iii.100%乙醇1分钟×2次；iv.二甲苯5分钟×2次。

e.Pertex封片剂封片。

④免疫组化（IHC）染色：

a.蒸馏水静置5分钟。

b.过氧化物酶封闭液室温孵育15分钟，封闭内源性过氧化物酶。

关键注意：临用前新鲜加入过氧化氢

c.蒸馏水洗涤5分钟。

d.热诱导抗原修复：根据一抗特性，切片置于煮沸的抗原修复缓冲液中孵育20分钟。

关键注意：使用与一抗匹配的缓冲液，遵循生产商推荐

e.缓冲液中自然冷却至室温。

f.1×PBS洗涤3次，每次5分钟，每次换液。

g.封闭：每张切片滴加200μL1%BSA/PBS，盖塑料盖玻片，室温封闭1小时。

关键注意：染色缸中放浸湿纸巾保持湿度，防止液体蒸发

h.滴加125μL0.5%BSA/PBS稀释的一抗，4℃孵育12-16小时，盖玻片覆盖均匀。

注：BSA可替换为与一抗匹配的血清（如山羊源一抗用正常山羊血清）。

i.1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

j.滴加125μL0.5%BSA/PBS稀释的二抗，室温孵育1小时，盖玻片覆盖。

k.1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

l.滴加150μL1×DAB显色液，室温孵育15分钟。

关键注意：DAB有毒，需在通风橱操作

注：孵育时间因抗体而异，镜下观察达到最佳染色即终止；建议设置阴性对照验证特异性。

m.蒸馏水洗涤5分钟终止反应。

n.苏木精复染：浸蘸4-5秒，自来水冲洗1分钟。

o.酸性乙醇分化：浸蘸4次，每次2秒。

p.自来水冲洗5分钟返蓝。

q.梯度脱水至二甲苯透明：

i.25%乙醇1分钟；ii.50%乙醇1分钟；iii.70%乙醇1分钟；iv.95%乙醇1分钟×2次；v.100%乙醇1分钟×2次；vi.二甲苯5分钟×2次。

r.Pertex封片剂封片。

1.肾小管类器官的构建与扩增通常需数周才能用于下游实验，实验规划需充分考虑该周期。

2.类器官建立后传代约15次，增殖能力会逐渐下降；建议在第5-6代（早期传代）进行慢病毒转导，保证生长状态与实验一致性。

3.本方案未包含病毒滴度测定；如需明确感染复数（MOI），建议提前通过滴度实验确定最佳病毒浓度。

问题1：酶解后类器官解离不完全

• 延长TrypLE孵育时间5分钟，加强机械吹打；或用灭菌玻璃巴氏吸管增强解离效果。

• 无需追求100%完全解离（会损伤细胞活力），大多数类器官解离为单细胞/小细胞团即可。

问题2：超速离心后无明显病毒沉淀

• 增加单管病毒上清体积，或合并多个培养皿上清后再离心，提高病毒总量。

• 使用带荧光报告基因的构建物，便于监测转染与转导效率。

问题3：肾小管类器官慢病毒转导效率低下

潜在解决方案

确保类器官处于活跃增殖状态，通常为传代后4–6天（具体依模型而定）。可提高转导时慢病毒颗粒的用量以提升效率。旋转感染后，换液前可让细胞恢复培养最长8小时。若转导后48小时细胞状态不佳，可推迟至转导后72小时再启动抗生素筛选。

问题4：转移类器官至模具时，石蜡在玻璃吸管内凝固

潜在解决方案

可替代玻璃吸管转移法：直接将盛有类器官与石蜡的玻璃样品瓶置于包埋机冷板上，使石蜡凝固。凝固后用镊子将石蜡块转移至金属模具，再放在加热块上重新熔融石蜡，随后继续完成包埋流程。

问题5：单细胞RNA测序流式分选后细胞活力低或细胞数量不足

潜在解决方案

若样本为冻存复苏细胞，需快速解冻细胞，并将培养基逐滴加入装有复苏细胞的15mL离心管中；切勿将解冻后的细胞直接加入预填培养基的离心管。

所有等待步骤均需将细胞置于冰上，最大程度降低细胞应激。

过滤操作中注意避免触碰或损坏细胞筛的滤膜，防止细胞损失。

参考文献：Protocol for lentiviral engineering and multi omic characterization of human kidney tubuloids