Western blot做到100～200 kDa以上的蛋白时，经常会遇到这种情况：内参和中小分子蛋白已经转得很好，目标蛋白却始终很弱，甚至完全没有信号。

大分子蛋白转膜困难，问题往往不只是“时间不够”。胶浓度过高、甲醇比例不合适、SDS不足以及转膜条件偏快，都可能让大分子蛋白大量滞留在胶内。

1. 分子量越大，越要关注凝胶孔径

大分子蛋白优先选择低浓度胶或低起始浓度梯度胶。聚丙烯酰胺浓度越高，凝胶孔径越小，大分子蛋白在其中迁移越困难。

可以先根据目标蛋白分子量选择起始条件：

这些范围用于确定预实验起点，不需要机械按分子量套用。实际还要结合蛋白本身迁移情况以及实验所用凝胶体系调整。

2. 条带一直挤在胶顶端，先改胶而不是先加抗体

如果大分子目标蛋白始终集中在分离胶顶部，说明当前跑胶条件本身就不理想。

这时即使提高一抗浓度、延长曝光时间，也不能解决蛋白仍然大量滞留在胶内的问题。应优先降低胶浓度、更换梯度胶，或者使用更适合超大分子量蛋白的凝胶体系。

图1｜不同凝胶体系对高分子蛋白分离及检测效果的影响

1. 甲醇既帮助蛋白结合膜，也会影响蛋白出胶

甲醇比例过高时，凝胶收缩会增加，大分子蛋白从胶内迁出的难度也会增加。

常规转膜液中经常使用约20%甲醇，这对很多中小分子蛋白并没有明显问题；但当150～200 kDa以上蛋白持续转不下来时，可以把甲醇作为重点优化参数。

2. 20%甲醇转不动，可以先尝试降到10%左右

大分子蛋白转移不充分时，可以从降低甲醇比例开始调整。如果原体系使用20%甲醇，可以尝试降低到10%左右，再观察目标区域的转膜效果。

甲醇也不是越低越好。比例过低会影响部分蛋白与膜的结合，因此调整后最好同时观察两件事：

胶里还剩多少蛋白，以及膜上的目标信号有没有增强。

如果胶内残留明显减少，但膜上信号反而没有改善，就不能继续单纯降低甲醇。

1. 0.01%～0.02% SDS可以作为起始优化范围

大分子蛋白滞留明显时，可以在转膜液中加入少量SDS提高迁移能力。

150 kDa以上蛋白可以先尝试0.01%～0.02% SDS。如果蛋白仍然明显留在胶内，再根据结果逐步调整，而不是一次加入很高浓度。

对于特别难转的蛋白，也可以在正式转膜前让凝胶先在含少量SDS、低甲醇或无甲醇的转膜液中短时间平衡，再进入正式转膜体系。

2. SDS加得太多，蛋白可能出了胶却留不住膜

SDS的作用是帮助迁移，但过量会降低蛋白与膜的结合。

因此，大分子蛋白转膜不能简单理解为“SDS越多越容易转”。如果SDS不断增加后胶内残留明显减少，但膜上信号并没有同步增强，就需要考虑蛋白已经离开凝胶，却没有被膜有效截留。

大分子蛋白转膜真正要找的是一个平衡：

降低甲醇帮助蛋白出胶，加入少量SDS增加迁移，同时保证蛋白能够稳定结合到膜上。

1. 大分子蛋白通常不需要为了“截住蛋白”改成0.2 μm

0.45 μm PVDF可以作为大分子蛋白Western blot的常用选择。

0.2 μm膜更多用于降低小分子蛋白穿膜风险。对于100～200 kDa甚至更大的蛋白，重点通常不是膜孔径太大，而是蛋白能否顺利离开凝胶并到达膜表面。

2. PVDF活化不充分，也会造成局部转膜异常

PVDF膜在组装转膜夹前要充分润湿。按照所用膜的要求完成甲醇或乙醇预湿，再放入转膜液平衡。

如果膜没有完全润湿，可能出现局部不均匀、白斑或目标区域信号异常。

图2｜Western blot湿转夹层组装及蛋白转移方向示意图

1. 快速高强度转膜不一定适合难转的大蛋白

大分子蛋白迁移速度慢，单纯提高电压并不能完全替代转膜时间。

对于传统湿转，可以根据目标蛋白选择较高强度短时间或较低强度长时间两种思路。例如100 V约1 h可以作为常规条件，而难转的大分子蛋白可以尝试降低电压、延长至数小时或过夜。

如果100～200 kDa以上目标蛋白总是转不完全，优先比较：

原条件 → 延长转膜时间 → 低压长时间转膜

而不是直接不断提高电压。

2. 时间延长以后，温度也必须一起控制

大分子蛋白长时间转膜时，低温条件非常重要。

转膜时间越长，体系发热越明显。缓冲液温度持续升高不仅影响转膜稳定性，还可能造成凝胶变形。

长时间湿转可以使用冰盒、冰浴或循环冷却系统控制温度。尤其是数小时或过夜转膜，不能只改时间而忽略降温。

1. 胶和膜之间不能留气泡

转膜夹组装完成后，胶和膜必须完整贴合。

滤纸、凝胶和膜都应充分浸润转膜液，组装过程中轻轻排出气泡。胶与膜之间只要存在气泡，对应区域就无法正常完成蛋白转移，最终常表现为膜上圆形或不规则空白。

图4｜气泡导致局部转膜失败

2. 夹层稳定贴合即可，不需要过度挤压

转膜夹不是压得越紧越好。海绵垫和滤纸的作用是保证各层充分接触，如果加入过多垫片，把凝胶压得明显变形，反而可能影响转膜均一性。

图5丨湿转三明治分层结构示意图

预染Marker主要用于判断转膜方向和粗略观察转膜过程，不能完全代表目标蛋白的真实转移效率。不同蛋白即使分子量相近，实际迁移和膜结合能力也可能不同。

大分子蛋白Western blot转不下来时，不要第一反应只延长转膜时间。

更合理的调整顺序是：先看胶浓度是否适合目标蛋白 → 再调整甲醇和SDS → 最后优化转膜时间和温度。

对于150～200 kDa以上蛋白，可以优先尝试更低浓度的凝胶、降低转膜液甲醇比例，并根据需要加入0.01%～0.02% SDS；

对于200 kDa以上、常规梯度胶始终分离和转膜不理想的蛋白，还可以考虑3%～8% Tris-acetate等更适合大分子量蛋白的凝胶体系。