体外磷酸化实验怎么做？从激酶反应到结果验证的完整流程

细胞水平的过表达、敲低结合磷酸化 WB，仅能证明蛋白间存在调控相关性，无法直接证实激酶‑底物的直接作用关系。

体外磷酸化实验（in vitro kinase assay）将激酶、候选底物与 ATP 置于简化的体外反应体系。当活性激酶可提升底物磷酸化信号，同时激酶失活、移除 ATP、突变磷酸化位点后该信号随之减弱，即可为二者的直接磷酸化调控提供关键证据。

图1丨激酶磷酸化核心生化机制图

体外磷酸化通常需要四类核心组分：

· 活性激酶：纯化重组蛋白，或经IP富集后保留活性的激酶；

· 候选底物：纯化全长蛋白、蛋白片段或合成肽段；

· ATP和Kinase Buffer：提供磷酸基团及Mg²⁺等激酶反应所需环境；

· 磷酸化检测体系：磷酸化位点抗体、泛p-Ser/Thr/p-Tyr抗体、放射性ATP、Phos-tag或质谱等。

正式实验前先确认重组蛋白纯度和浓度。激酶还要关注活性状态，底物则尽量使用结构完整、可溶性好的蛋白。

如果已经预测出具体磷酸化位点，可以同步准备WT底物和磷酸化位点突变体，例如Ser/Thr常做Ala突变，Tyr常做Phe突变。后面的结果解释会清楚很多。

Step 1｜冰上准备反应体系

所有蛋白冰上解冻，轻柔混匀后短暂离心。

一个常见起始体系可以先按20～40 μL/反应设计，基本组成包括：

ATP可以从100～200 μM附近开始摸条件。不同激酶对ATP、Mg²⁺、Mn²⁺和DTT的要求差异较大，优先沿用该激酶已有的活性反应体系。常见蛋白激酶反应可从30℃、30 min作为预实验起点。

Step 2｜ATP最后加入，统一启动反应

先配好Kinase Buffer、激酶和底物，最后加入ATP启动反应。

同批样本按照固定顺序连续加样，尽量让各管真正的反应时间接近。组数较多时，可以提前配好公共Master Mix，再分装到各反应管中。

Step 3｜30℃孵育约30 min

将反应体系置于30℃孵育约30 min。

第一轮建立体系时，可以围绕激酶量、底物量和反应时间设置小梯度。例如保持底物量稳定，先比较不同激酶量；找到明显磷酸化窗口后，再进一步优化反应时间。

这里追求的是一个清晰的动态范围：完整反应组信号明显，同时阴性对照保持干净。

Step 4｜加入SDS上样缓冲液终止反应

反应结束后立即加入SDS-PAGE上样缓冲液。

使用3× Sample Buffer时，可以按40 μL反应液＋20 μL 3×上样缓冲液处理，混匀后于95～100℃加热2～5 min，终止激酶反应并完成蛋白变性。

随后短暂离心，进入SDS-PAGE和Western blot。

Step 5｜先看磷酸化，再看总底物

有明确磷酸化位点抗体时，优先检测对应的p-Substrate。

同一批样本还要检测Total substrate，确认各组加入的底物量接近。结果分析可以采用：p-Substrate / Total substrate 进行相对比较。

如果有WT和位点突变体，建议在同一块胶或同一批实验中完成检测。

图2丨体外磷酸化实验全步骤示意图

一套有说服力的结果通常为：

WT＋活性激酶组磷酸化明显增强；Kinase-dead组降低；候选位点突变后信号进一步下降。

位点突变后仍保留部分信号时，可以继续考虑同一底物上存在多个磷酸化位点。

1. 泛磷酸化抗体

p-Ser、p-Thr或p-Tyr抗体可以先判断底物整体磷酸化变化。

这种方法适合前期筛查，具体位点仍需要突变或质谱继续确认。

2. Phos-tag SDS-PAGE

磷酸化蛋白与Phos-tag结合后迁移速度下降，常表现为条带上移或形成多个迁移带。

适合观察底物整体磷酸化状态，尤其适合缺少可靠位点抗体的情况。

图3丨Phos-tag 和普通 SDS-PAGE 对比

3. γ-³²P-ATP

使用放射性ATP可以直接追踪磷酸基团进入底物，灵敏度高，也是经典体外激酶实验方法。实验需要具备放射性同位素操作资质和相应防护条件。

4. ADP生成检测

激酶反应每转移一个磷酸基团，同时会将ATP转化为ADP，因此可以通过ADP生成量评价激酶活性。

这类发光法很适合酶活梯度、抑制剂筛选和高通量检测。结果反映的是整体激酶反应活性，具体哪一个底物位点发生磷酸化还需要其他方法继续验证。

图4丨Phos-tag SDS-PAGE 分离原理示意图

“无激酶组也有磷酸化信号”现象中，哺乳细胞表达纯化的底物可能已经带有基础磷酸化，亲和纯化样本中也可能夹带其他激酶。条件允许时，可以采用来源更干净的重组底物，或者结合位点突变进一步判断。

如果研究目标是证明“Kinase A直接磷酸化Substrate B的SerXXX位点”，比较完整的实验组合是：

纯化Kinase A＋WT Substrate B体外磷酸化 → phospho-SerXXX检测 → Kinase-dead对照 → SXXXA突变验证。

这样从激酶活性、直接反应到具体位点，证据能顺着一条线接起来。

体外磷酸化实验可以直接记住四个核心组分：Kinase＋Substrate＋ATP＋Kinase Buffer。

操作上则是一条很短的时间线：配反应体系 → ATP启动 → 30℃孵育 → SDS终止 → WB/Phos-tag/放射性或质谱检测。

活性激酶、Kinase-dead、WT底物和磷酸化位点突变体一起做，能够把“相关性”进一步推进到“直接激酶—底物关系”和具体磷酸化位点。