类器官整装免疫荧光染色（Whole-mount immunofluorescence）能够保留类器官完整的三维结构，配合共聚焦Z-stack，可以观察标志蛋白在类器官内部的空间分布。

整装染色的核心难点从来不是“染出荧光”，而是在保持三维结构完整的前提下，让抗体均匀渗透到类器官内部。本文按实验流程拆解操作标准、调参逻辑与高频问题解决方法。

图1丨类器官整装免疫荧光基本流程

1. 低温解聚，减少机械损伤

染色前通常需要将类器官从Matrigel/BME中回收。可使用Cell Recovery Solution等低温解聚体系，在冰上或4 ℃条件下使基质逐渐溶解，以类器官能够完整释放为准。

过程中可以轻轻混匀，但不要反复快速吹打。回收后采用温和离心条件收集类器官，避免离心力过大造成结构受压或团聚。

2. 转移时使用宽口枪头

普通枪头口径较小，大型类器官在吸打过程中容易受到剪切而破裂。

涉及回收、洗涤和转移时，建议使用宽口或剪口枪头，并尽量做到：

· 缓慢吸取和释放；

· 减少不必要的吹打和换管；

· 沿管壁加入液体；

· 对容易黏壁的样本使用低吸附管或预润洗枪头。

1. 固定兼顾结构和抗原暴露

整装免疫荧光常用4%多聚甲醛固定。类器官越大、结构越致密，通常需要更长的固定时间。

固定不足容易造成后续通透和洗涤时结构松散；固定过度蛋白交联过度会遮蔽抗原表位，同时致密的交联结构会大幅增加抗体渗透阻力，直接导致中心区域无信号；

2. 通透条件根据样本大小调整

常用Triton X-100进行通透，可从0.1%～0.5%范围开始优化。

小型、结构疏松的类器官可采用较温和条件；大型或致密类器官则需要适当延长通透时间。

如果出现外围信号强、中心几乎没有信号，优先考虑：延长通透时间，而不是直接大幅提高Triton浓度。

在检测膜蛋白时需要注意去垢剂过强可能损伤膜结构。

1. 封闭

可使用正常血清或BSA进行封闭。小型类器官可从室温1～2 h开始，样本较大或背景较高时适当延长。

封闭不足容易增加非特异性荧光背景。

2. 一抗孵育

一抗可以从4 ℃孵育24 h左右作为起始条件。对于较大、结构致密的类器官，可以延长至24～48 h。

孵育过程中保持低速轻摇，让类器官充分接触抗体液，避免样本长时间沉积或聚集成团。

中心信号不足时，建议按照：通透条件 → 一抗孵育时间 → 抗体浓度的顺序调整，不要一开始就提高抗体浓度。

3. 二抗孵育

二抗同样需要进入三维结构，可根据类器官大小采用数小时至4 ℃过夜孵育。从加入荧光二抗开始全程避光。

DAPI或Hoechst可与二抗同时加入，也可以单独进行核染色。

图2丨类器官整装免疫荧光染色后的共聚焦成像示例图

整装染色中的洗涤不仅要清除表面的游离抗体，还需要让内部未结合抗体逐渐扩散出来，因此通常比2D染色需要更长时间。

换液时可以让类器官自然沉降或采用温和离心，再缓慢吸去上清。不要直接对着类器官快速加液，也不要为了“洗干净”反复吹打。

背景偏高时，优先检查：抗体浓度是否过高、封闭是否充分、洗涤时间是否不足。

1. 外围亮，中心不亮

最常见原因是抗体渗透不足，排查顺序：通透不足 → 一抗孵育时间短 → 类器官体积过大 → 固定过度。

可以先延长通透和一抗孵育时间。如果大型类器官始终无法获得稳定中心信号，可改用冰冻或石蜡切片。

2. 染色不均，局部没有信号

重点检查样本是否在回收过程中发生机械损伤，以及孵育时是否大量堆积在一起。

全程减少吹打，孵育时低速轻摇，并保证抗体液能够充分接触类器官表面。

3. 整体背景偏高

常见原因包括封闭不足、抗体浓度过高、洗涤不足以及残留基质胶过多。

可依次延长封闭和洗涤时间，再适当降低抗体浓度。

普通荧光显微镜适合快速判断染色是否成功和观察整体形态，但较难反映类器官内部真实的空间分布。正式结果更适合使用共聚焦显微镜进行Z-stack扫描。

不同处理组应尽量统一：物镜、激光功率、Gain、Z-step、扫描范围、后期处理参数。

扫描范围应覆盖需要分析的整个类器官，而不是只选择荧光最强的一层。

对于体积较大的类器官，如果深层信号受光散射影响明显，可以根据研究目的增加折射率匹配或组织透明化步骤。

图5｜Z-stack与三维重构示例

整装染色更适合观察完整三维结构和空间分布；如果类器官体积较大，或者重点关注中心区域和精细定位，切片染色通常更稳定。

图 6 丨类器官冰冻切片免疫荧光染色结果图

类器官整装免疫荧光最需要控制三个环节：

回收时减少机械损伤、通透和抗体孵育保证内部渗透、成像时完整采集Z轴信息。

出现“外围亮、中心不亮”时，优先从通透和抗体孵育时间开始调整；如果大型类器官始终无法获得稳定内部信号，则没有必要强求整装染色，可以改用切片方案。

参考资料

1. STAR Protocols：whole-mount immunofluorescence staining of ECM gel-embedded organoids.

2. Whole-mount immunofluorescence staining protocols for organoid models.

3. Nature Communications：whole-mount staining and three-dimensional imaging of organoid models.