Co-IP（Co-immunoprecipitation，共免疫沉淀）常用于验证蛋白是否存在于同一复合物中。但真正做实验时，常见的却是两个极端：目标蛋白在WB里条带很清楚，到了IP却拉不下来；或者IP有信号，但背景重、IgG组也有条带，结果很难解释。

本文从裂解体系、抗体磁珠、对照设置、洗涤强度、结果优化、证据等级六个维度，拆解全流程的调参逻辑和避坑要点。

图1丨IP 实验标准流程示意图

1. Co-IP不能直接照搬WB的强裂解条件

常规WB经常使用RIPA等裂解体系，其中可能含有SDS、脱氧胆酸钠等较强去垢剂，有利于充分释放蛋白，但同时也可能破坏部分非共价蛋白相互作用。

对于稳定的强互作，较强裂解条件有时仍能检测到信号；但对于弱互作、瞬时互作或部分膜蛋白复合物，裂解强度过高可能在IP开始前就使复合物解离。

因此，新建立的Co-IP体系通常更适合从NP-40、Triton X-100等相对温和的非离子型去垢剂体系开始，并全程保持低温，减少复合物在处理过程中的解离。

2. 不同裂解体系根据互作稳定性选择

实际选择时不能只看“蛋白提取得多不多”。如果目标蛋白在Input中很多，但候选互作蛋白始终拉不下来，就要检查裂解条件是否过强。

3. 裂解条件按结果逐步调整

目标蛋白能成功IP，但候选蛋白信号很弱，可以依次尝试降低去垢剂浓度、降低盐浓度，并减弱后续洗涤强度。

如果整体非特异背景很高，则可以适当提高盐浓度或去垢剂强度。

每轮预实验尽量只改变一个变量，避免同时调整裂解液、抗体量和洗涤次数，否则很难判断真正影响结果的环节。

图2丨不同裂解液 Co-IP 效果对比实验结果图

1. Protein A和Protein G按抗体种属及亚型选择

Protein A和Protein G都通过IgG Fc区域结合抗体，但对不同物种和IgG亚型的亲和力不同。常见选择可以参考：

图3丨Protein A 抗体结合原理示意图

2. 孵育顺序：先抗体 - 磁珠结合，还是先抗体 - 样本孵育？

两种方法各有优劣，需根据实验目的选择：

先让抗体结合Protein A/G磁珠，再加入蛋白样本：这种方法非特异性结合更低，背景更干净；适合抗体亲和力强、互作较稳定的体系，操作更简便。

先让抗体与蛋白样本在4℃条件下充分孵育，再加入磁珠捕获复合物：抗体与蛋白更充分接触，IP 效率更高，适合弱互作、低丰度蛋白；缺点是非特异结合略多，背景偏高。

调参建议：拉不下来优先试 “抗体 + 样本先孵育过夜” 的方案；背景高就换成 “抗体先挂珠” 的方案。

3. WB 能用的抗体，不一定适合 IP

这是高频踩坑点：同一靶标，WB 条带很漂亮，IP 却完全拉不下来。

核心原因是两种实验识别的蛋白表位不同：WB 检测的是变性后的线性表位，而 IP 结合的是天然构象的蛋白。如果抗体的免疫原是变性蛋白或合成多肽，它很可能只识别线性表位，无法结合天然折叠的蛋白，自然无法完成 IP 捕获。

避坑建议：选购抗体时必须确认 “经 IP 验证”；无验证信息的抗体，不建议直接用于正式 IP 实验。

1. Input先确认样本中确实存在目标蛋白

Input是免疫沉淀前保留的一部分总蛋白。

它主要回答两个问题：目标蛋白是否成功提取，以及候选互作蛋白在原始样本中是否具有可检测表达。

Input 没条带，说明蛋白没提出来或表达量太低，IP 自然拉不下来；Input 有信号而 IP 无信号，才是 IP 体系的问题。

2. IgG对照用于排除非特异结合

用与IP抗体相同物种、相同亚型的无关IgG，其余步骤与实验组保持一致。

用来排除 “蛋白非特异性结合在抗体 / 磁珠上” 的假阳性 ——IgG 组无条带、IP 组有条带，才能说明结合是特异性的。

3. Beads only和阳性对照用于进一步定位问题

Beads only只加入磁珠、不加IP抗体，主要用于判断蛋白是否直接吸附在磁珠上。在建立新体系或背景异常高时比较有用。

如果目标蛋白存在已知互作伙伴，还可以加入阳性对照。阳性对照也无法拉下来时，应优先检查整个IP体系，而不是直接判断新的候选蛋白不存在互作。

图4丨Co-IP 实验标准对照结果示例

1. 背景高时逐步增加洗涤强度

捕获完成后，磁珠上除了目标复合物，还会带有不同程度的非特异结合蛋白。

背景较高时，可以从以下几个方向逐步调整：

·增加洗涤次数；

·适当延长单次洗涤时间；

·提高NaCl浓度；

·适当增加非离子型去垢剂浓度。

常规实验可以先从3～4次洗涤作为起始条件，再根据背景调整。

2. 候选互作蛋白信号弱时减少过度洗涤

如果目标蛋白IP效率很好，但候选蛋白信号很弱，除了检查裂解液，还要注意洗涤条件是否过强。

弱互作体系可以适当减少洗涤次数、降低盐浓度或缩短洗涤时间，并保持低温、轻柔操作。

这里的核心不是“洗得越干净越好”，而是找到去除非特异蛋白和保留真实互作之间的平衡。

图5丨洗涤条件优化前后的条带效果对比

抗体重链 / 轻链干扰目标条带怎么办？

如果 IP 抗体和 WB 一抗是同物种，二抗会同时识别 IP 抗体的重链（约 55kD）和轻链（约 25kD），遮挡附近的目标蛋白。解决方法按优先级排序：

1. WB 一抗换用不同物种的抗体，从根源避免交叉识别；
2. 选用 HRP 直接标记的二抗（特异性识别重链或轻链），或选用 TrueBlot 二抗；
3. 降低 IP 抗体用量，或在制样煮沸前洗脱磁珠，减少抗体变性释放。

图6丨Co-IP 实验中的抗体重链干扰示例

1. 单向Co-IP后尽量增加反向验证

例如先完成：

IP：蛋白A → WB：蛋白B

检测到B后，在抗体条件允许的情况下，可以进一步进行：

IP：蛋白B → WB：蛋白A

反向Co-IP能够从另一个方向验证两种蛋白是否共同存在于同一复合物中。

2. 标签Co-IP可以辅助，但不能完全替代内源验证

对于内源蛋白表达较低、抗体IP性能不足的体系，可以使用FLAG、HA、Myc等标签蛋白辅助验证。

但过表达会改变细胞内蛋白丰度，也可能增加原本发生概率较低的蛋白接触，因此标签Co-IP最好与内源Co-IP或其他实验结果结合解释。

3. Co-IP阳性不能直接证明两个蛋白直接结合

Co-IP 的本质是捕获蛋白复合物，阳性结果只能说明两个蛋白在细胞内存在于同一个复合物中，但无法证明是直接结合 —— 中间可能有第三个蛋白、核酸或其他分子作为桥梁。

如果研究需要进一步证明二者直接结合，还需要结合GST pull-down、SPR、MST等其他方法验证。

图7丨正向与反向 Co-IP 验证结果示例

实际排查可以按照：

看Input → 检查裂解液 → 检查IP抗体 → 匹配Protein A/G → 调整孵育条件 → 优化洗涤强度，逐步进行。

Co-IP没有一套适合所有蛋白互作的固定参数。真正需要优化的，是在目标蛋白能够稳定富集、非特异背景可控，同时尽可能保留原有蛋白复合物的条件下完成检测。

参考资料：

1.Thermo Fisher Scientific. Co-Immunoprecipitation (Co-IP).

2.Thermo Fisher Scientific. Protein IP, Co-IP and Pulldown Support: Getting Started & Troubleshooting.

3.Cell Signaling Technology. Immunoprecipitation Protocol for Native Proteins.

4.Abcam. Immunoprecipitation Troubleshooting Guide.