本研究采用“现象发现-理论预测-实验验证-机制解析-体内验证”的闭环逻辑，层层递进揭示管腔形态的调控规律：

1.表型定量：系统表征两类类器官的管腔形态动态差异，明确核心特征。

2.理论建模：通过多细胞相场模型，预测管腔压力与细胞增殖速率的组合效应。

3.参数验证：实验测量两类类器官的真实增殖速率与管腔静水压，验证模型预测。

4.因果验证：分别干预细胞增殖、上皮通透性，验证两者对管腔形态的因果调控。

5.机制解析：阐明管腔压力差异的分子基础——上皮紧密连接通透性。

6.体内延伸：在小鼠胰腺发育中验证通透性的动态变化与生理功能。

1.表型发现：两类胰腺类器官的管腔形态发育轨迹存在本质差异

研究目标：准确定量两类类器官的管腔拓扑与几何特征，排除干扰因素，确立研究对象的可靠性。

图1

①形态发育轨迹分化

培养第2天起两类类器官管腔形态出现差异：球型类器官始终维持单个球形管腔；分支型类器官先形成多个独立小管腔，第2天管腔数量达到峰值，随后管腔相互融合，最终形成连通的复杂网络结构（图1b-c）。

定量数据：第2天分支型类器官的管腔数量与细胞数呈线性正相关，提示管腔新生伴随细胞分裂发生（图1d）。

②关键几何参数差异

管腔占比：两类类器官的管腔体积占比均随培养时间升高，但第2天起分支型显著低于球型；培养第6天，球型管腔占比约61.1%，分支型仅约16.2%（图1f，P<0.001）。

细胞增殖：分支型类器官上皮细胞数量增长显著更快，第6天细胞核数显著高于球型（图1g，P<10⁻¹⁵）。

表面积/体积比：培养后期分支型管腔的表面积/体积比显著更高，对应复杂迂曲的网络结构；球型管腔始终维持最低比值，符合球形的几何特征（图1h）。

图2

③排除混淆因素

排除表面分支的次生效应：用2MDa葡聚糖对分支型类器官进行渗透压压缩，外部分支结构减少，但内部管腔网络的总长度、管腔占比均无显著变化，证明管腔形态是上皮的内在属性，而非外部分支的次生结果（扩展数据图2j-k）。

排除细胞凋亡贡献：两类类器官的活化半胱天冬酶3水平无统计学差异，细胞凋亡不参与形态差异调控（扩展数据图2l-m）。

2.理论预测：相场模型揭示“管腔压力-细胞增殖”共同决定管腔形态

研究目标：通过计算模拟，提出管腔形态调控的核心假说，为后续实验提供理论指引。

图3

图4

①模型设定

构建二维多细胞相场模型，纳入两个核心调控参数：

• 细胞周期时长τᵥ：调控细胞增殖速率，τᵥ越短则增殖越快；细胞分裂时会在胞质断裂处产生新生微管腔。

• 管腔渗透压差ξ：管腔与外界环境的渗透压差，驱动管腔膨胀生长，与管腔静水压呈线性正相关。

②核心模拟结果

模型输出的形态相图完整重现了两类类器官的表型（图3b(ii)、图3d）：

高ξ（高渗透压/压力）+长τᵥ（慢增殖）：管腔膨胀占主导，小管腔快速融合，最终形成单一大球形管腔，对应球型类器官表型。

低ξ（低渗透压/压力）+短τᵥ（快增殖）：细胞分裂持续产生新生小管腔的速率超过管腔融合速率，最终形成多而小的复杂连通管腔，对应分支型类器官表型。

③定量映射

根据体外类器官的管腔数量、占比数据，将两类类器官定位到相图中：

• 球型类器官：ξ≈0.3，τᵥ≈60

• 分支型类器官：ξ≈0.14，τᵥ≈40

• 模型预测两类类器官的管腔压力比值约为2.1倍。

3.实验验证：两类类器官的增殖速率与管腔压力存在定量差异

研究目标：实验测量两类类器官的核心参数，验证模型的定性与定量预测。

图5

①增殖速率验证：分支型类器官增殖更快

实验方法：EdU掺入实验，标记2小时内处于S期的细胞。

核心结果：

培养早期（6h、24h）两类类器官增殖水平相近；48h起球型类器官的EdU阳性比例显著低于分支型（图5f）。

48–96h区间内，分支型类器官的细胞倍增时间比球型快1.4倍，与模型中“分支型τᵥ更短”的设定一致（图5g）。

②管腔静水压验证：球型类器官管腔压力显著更高

图6

测量方法：双光子激光消融法——用激光在上皮层制造微小通道，通过哈根-泊肃叶方程，结合液体流出速率、通道半径、上皮厚度、管腔液体黏度计算管腔静水压ΔP。

黏度校准：通过3D粒子追踪技术结合斯托克斯-爱因斯坦方程，测得管腔液体平均黏度为2.1±0.3mPa·s（图6）。

③核心定量结果：

培养第6天，分支型类器官平均管腔静水压为2.9Pa，球型类器官为25.4Pa，球型压力约为分支型的8.8倍（图5j，P<10⁻⁵）。

对管腔体积进行匹配校正后，球型管腔压力仍约为分支型的7倍（图h）。

球型管腔压力随体积增大而升高，分支型管腔则无此相关性，符合渗漏上皮无法维持压力的特征（图e）。

模型吻合度：实验测得的压力比值（~7倍）与模型预测比值（2.1倍）趋势完全一致，处于同一数量级，有力验证了“压力-增殖协同调控管腔形态”的核心假说。

4.因果验证1：细胞增殖是维持管腔复杂形态的必要条件

图7

①实验设计

用DNA聚合酶抑制剂阿非迪霉素（3µM）处理分支型类器官，完全阻滞细胞周期；分别在早期（第2–4天）和晚期（第4–6天）给药，观察管腔形态变化。

②核心结果

表型转变：晚期（第4–6天）给药后，分支型类器官的管腔数量显著减少、管腔占比显著升高，整体形态向单球形转变（图7b-c）。

模拟重现：在相场模型中终止细胞分裂，模拟增殖停滞，可完全复现“管腔数量下降、占比升高、逐渐融合为单球形”的动态过程（图7d-g）。

③机制结论

快速增殖是维持管腔系统非平衡态的关键：细胞分裂持续产生新生小管腔，抵消了管腔自发融合的热力学趋势；一旦增殖停滞，管腔会通过自发融合逐渐松弛为能量最低的单球形结构。

5.因果验证2：上皮通透性通过调控管腔压力决定形态

研究目标：解析两类类器官管腔压力差异的分子机制，验证上皮通透性的因果调控作用。

图8

①线索发现：福斯高林无法有效升高分支型管腔压力

预期：CFTR激活剂福斯高林可促进氯离子分泌，升高管腔渗透压与压力。

实际结果：福斯高林仅轻度扩张管腔体积，管腔静水压仅从2.9Pa升至4.6Pa，无法诱导形态向球形转变。

推论：分支型类器官的上皮存在渗漏，无法有效滞留溶质与水分，因此难以维持高管腔压力。

②通透性差异验证：分支型上皮具有渗漏性

实验方法：向培养基中加入10kDa荧光葡聚糖，观察其是否穿透上皮进入管腔。

核心结果：

球型类器官管腔无葡聚糖信号，上皮屏障紧密；

分支型类器官管腔有明显葡聚糖聚集，且细胞间隙可见荧光，证实上皮细胞旁通透性高；

该差异从培养第2天持续至第7天，是稳定的表型特征（图8a）。

③功能验证：增加通透性可使球型类器官向分支型转化

工具：非细胞毒性产气荚膜梭菌肠毒素片段（cCPE-647），通过结合闭合蛋白（claudin）破坏紧密连接，特异性增加上皮通透性。

急性效应：cCPE处理后，葡聚糖快速进入球型类器官管腔，随后管腔迅速塌陷、横截面积显著下降。

长期效应（第2–6天持续处理）：

约50%的球型类器官转变为分支样表型，管腔占比显著下降、管腔数量显著增加；

总细胞数量无变化，证明形态改变不依赖增殖，由通透性-压力轴直接介导；

管腔静水压从对照组的36.8Pa降至处理组的7.6Pa，直接证实通透性升高降低管腔压力（图8h）。

可逆性：第6天撤去cCPE后，类器官无法恢复为球形，提示形态转变具有一定的不可逆性。

④分子基础：闭合蛋白表达谱差异

转录组分析显示，两类类器官的闭合蛋白（claudin）表达谱存在显著差异：

• 分支型高表达claudin-10（可增加氯离子旁细胞通透性），是其低压、渗漏特性的分子基础；

• 球型高表达claudin-2等屏障型亚型，维持上皮紧密性与高管腔压力。

• 不同闭合蛋白的组合表达（“闭合蛋白密码”），共同决定了上皮的通透性特征与管腔压力水平。

6.体内验证：胰腺发育中上皮通透性的动态转变具有生理功能

研究目标：将类器官中的发现延伸至体内胚胎发育，验证其生理意义。

图9

① 发育过程中上皮通透性的动态变化

实验方法：收集E11.5、E13.5、E15.5、E17.5四个阶段的小鼠胰腺外植体，用10kDa葡聚糖孵育检测通透性。

核心结果：

E11.5、E13.5阶段：胰腺上皮为渗漏型，管腔内可见葡聚糖信号；

E15.5、E17.5阶段：上皮完全封闭，管腔内无葡聚糖信号；

结论：小鼠胰腺发育过程中存在**“渗漏型→封闭型”上皮转变**，关键时间节点约为E15.5，与导管丛网络向树状结构重塑的发育时程高度吻合（图9a-c）。

②功能验证：通透性封闭是正常导管形态发生的必要条件

实验设计：用cCPE处理E15.5胰腺外植体（此时上皮已正常封闭），持续48小时观察导管形态。

核心结果：

cCPE成功增加了E15.5胰腺上皮的通透性；

处理组出现大量孤立的导管管腔，正常连通的导管网络被破坏，导管形态发生异常（图9g-i，P<0.05）。

生理结论：胚胎发育中后期上皮通透性的适时封闭，是维持管腔压力、保障胰腺导管网络正常形态发生的必要条件。

1.核心机制模型

上皮紧密连接的通透性水平决定了管腔静水压的上限；管腔压力与细胞增殖速率的平衡，最终决定管腔形态：

• 高压力+慢增殖→管腔膨胀融合占主导，形成单球形管腔；

• 低压力+快增殖→新生管腔持续产生，形成复杂连通的管腔网络。

2.科学价值

理论创新：从生物物理视角揭示了管腔形态多样性的全新调控机制，补充了传统细胞分子机制之外的力学调控逻辑，解释了从单管腔到复杂分支网络的形态谱来源。

生理意义：发现了胰腺发育中“上皮渗漏-封闭”的动态转变，为胰腺导管网络重塑的发育机制提供了新的力学假说。

3.转化价值：

为囊性纤维化、多囊肾病、胰腺囊性病变等管腔异常疾病提供了“靶向通透性-压力轴”的治疗新思路；

为类器官组织工程中精准调控管腔形态、构建功能性器官结构提供了可操作的理论指导。