肠道类器官的标准化实验操作教程及质量评估方法！

从小肠和结肠的人活检组织中提取隐窝，随后使用含生长因子的扩增培养基进行穹顶状培养，以促进类器官生长。

1.细胞制备

①组织样本置于含高级DMEM/F12和普里莫星的50mL离心管中，4℃保存直至分离。为确保最佳效果，30mg组织需在24h内解离，以防止细胞死亡和冻融损伤。

②为每份组织样本制备新鲜消化液：在15mL离心管中加入5mL高级DMEM/F12，再加入5mg/mLII型胶原酶和10μMY27632，混匀后4℃保存备用。

③将组织转移至10cm培养皿中。用两把手术刀将组织切成约1mm³的小块，用移液管加入5mL消化液。

④将培养皿中的内容物转移至15mL离心管，用封口膜密封管口，并用消化液冲洗培养皿。

⑤将离心管置于37℃、140rpm摇床中振荡30-45min进行解离。解离约30min后，观察到溶液高度浑浊且无明显团块。

⑥用100μm细胞筛将解离后的组织过滤至50mL塑料离心管中。

⑦450×g、4℃离心5min，弃上清。若存在红细胞，可见暗红色沉淀，将沉淀重悬于3mL红细胞裂解液中，室温孵育5min。孵育结束后，向细胞悬液中加入5mL高级DMEM/F12，450×g、4℃离心5min，弃上清。

⑧用10mL高级DMEM/F12洗涤沉淀2次，450×g、4℃离心5min，弃上清。

⑨将沉淀重悬于原溶液中，并与细胞外基质（BME）混合。

2.肠道类器官培养

①将细胞悬液接种至预热的细胞培养板中。

②将培养板倒置，置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中静置20min。

③每孔加入500μL含10μMY27632的培养基，置于培养箱中培养。

④约1周后，进行机械分割以实现类器官的持续培养和传代。

3.人肠道类器官的机械分割、传代与扩增

①吸去培养类器官的培养基，用4℃预冷的1mL高级DMEM/F12洗涤，用移液管将类器官收集至含4℃高级DMEM/F12的离心管中。

②450×g、4℃离心5min，弃上清。

③用P1000移液管加入高级DMEM/F12，吹打5-10次，直至沉淀中无明显大团块。

④重复离心步骤（450×g、4℃离心5min），弃上清。

⑤将沉淀重悬于300-400μLBME中（BME终浓度为75%-100%）。

⑥将细胞悬液接种至预热的细胞培养板中。

⑦将培养板倒置，置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中静置20min。

⑧加入扩增培养基，每2-3天更换一次培养基。约1周后，进行机械分割传代。

⑨该过程可促进新类器官的自组织以及类器官内干细胞和分化扩增细胞的增殖，最终形成类器官。通过重复机械分割和传代，可长期维持类器官的生长和特征。

4.核心环境条件

培养环境为37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱。所有培养步骤均需在无菌环境中进行，以防止污染。

1.hPSCs的维持

①人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞在基质胶包被的培养皿中，用mTesR1培养基维持培养。

②根据细胞密度，约每4天传代一次。

③传代时，用无血清DMEM/F12洗涤细胞，加入含1mg/mL分散酶或Accutase酶的DMEM/F12培养，直至集落边缘开始从培养皿脱离。

④用DMEM/F12洗涤细胞2次，最后一次洗涤后更换为mTesR1培养基。

⑤刮取或轻轻吹打集落，使其形成小团块。

⑥将细胞传代至新鲜的基质胶包被培养皿中。

⑦第0天，在添加10μMY27632的mTesR1培养基中培养细胞。

⑧第1天，更换为mTesR1培养基，置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养。

2.hPSCs向定形内胚层分化

①用于类器官分化的细胞，传代密度需高于hPSCs维持培养的密度。细胞生长第2天达到80%汇合度时，启动类器官分化。

②采用激活素A分化方案处理3天：在RPMI1640培养基中加入100ng/mL激活素A，连续处理hPSCs3天，每24h将dFBS浓度从0%提高至2%。

3.定向分化为后肠

①从定形内胚层分化第4天起，更换为后肠培养基。

②在添加2%dFBS、500ng/mLFGF4和500ng/mLWNT3A（或3μMCHIR99021）的DMEM/F12培养基中培养4-6天。

③每2天更换一次培养基。

4.定向分化为人肠道类器官

①经后肠生长因子处理4-6天后，培养物中会形成3D悬浮球。

②将悬浮球包埋入基质胶中。

③基质胶凝固后，将其转移至含L-谷氨酰胺、10μMHEPES、N2（可选）和B-27补充剂、青霉素/链霉素的人肠道类器官基础培养基中。在人肠道类器官完全培养基中添加生长因子（200-500ng/mLRspo1、40-100ng/mL头蛋白及100ng/mLEGF）。

④每2-4天更换一次培养基。

5.传代

①肠道类器官培养10-14天后，直径可达0.5-2mm。

②轻轻吹打，将肠道类器官从基质胶穹顶中分离，去除类器官周围残留的基质胶碎片。

③用手术刀片或切碎器将肠道类器官按1:3至1:6的比例机械分割。

收集包含隐窝结构的肠道类器官碎片。

④用高级DMEM/F12冲洗肠道类器官管腔，去除死细胞。

⑤在4孔培养板中加入45μL未稀释的基质胶，形成基质胶穹顶。

⑥将5-7个小的肠道类器官碎片接种至基质胶穹顶中，37℃、5%CO₂孵育10min，使基质胶穹顶凝固。

⑦额外加入5μL基质胶覆盖穹顶。

⑧加入700μL预热的肠道类器官扩增培养基，37℃培养，每2天更换一次培养基。

6.白细胞介素2诱导的人肠道类器官成熟

①当培养物中形成3D悬浮球（后肠）时，将其包埋入基质胶中，此传代记为人肠道类器官的第0代（P0）。

②基质胶凝固后，将悬浮球置于含L-谷氨酰胺、10μMHEPES、B-27补充剂及青霉素/链霉素的肠道类器官基础培养基中。用于肠道类器官扩增的培养基需添加生长因子（200-500ng/mLRspo1、40-100ng/mL头蛋白及100ng/mLEGF）。

注：Rspo1和头蛋白的浓度范围可根据靶细胞的多样性及研究目的进行调整。

③每2-4天更换一次培养基。从第0代（P0）至第2代（P2），每日添加新鲜的1ng/mLIL-2处理培养物。

④肠道类器官培养10-14天后，采用传统的肠道类器官传代方法进行传代。

⑤每2天更换一次肠道类器官扩增培养基。

7.核心环境条件

①培养环境为37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱。所有培养步骤均需在无菌环境中进行，以防止污染。此外，后肠阶段后，hPSC来源的类器官需至少培养28天，才能获得肠道干细胞特征。

注：培养28天时，类器官无G蛋白偶联受体5（LGR5）表达，但广泛表达无刚毛鳞甲复合体同源物2（ASCL2），且表达不局限于SOX9阳性增殖区。然而，培养至56天的类器官，在与SOX9阳性区重叠的有限上皮结构域中，可观察到ASCL2和LGR5的共表达。

1.形态学质量

①成体干细胞来源的肠道类器官（hASC-IOs）：呈芽状形态，具有中央管腔，保留环形上皮细胞结构。

②多能干细胞来源的肠道类器官（hPSC-IOs）：大小为0.5-2mm，呈芽状结构，具有与环形上皮细胞紧密相连的中央管腔。周围的原始间充质（肠基质细胞）可促进高度复杂上皮结构的形成。

③成熟hPSC来源的肠道类器官（Mat-hIOs）：体积大于hPSC-IOs（1-2mm），具有更多、更复杂的芽状结构。形成由原始间充质（肠基质细胞）包裹的复杂上皮结构。

2.多种细胞类型差异

①成体干细胞来源的肠道类器官（hASC-IOs）：包含肠道干细胞、过渡扩增细胞、肠上皮细胞、杯状细胞及肠内分泌细胞。

②多能干细胞来源的肠道类器官（hPSC-IOs）：包含肠道干细胞、过渡扩增细胞、肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞及肠内分泌细胞，外被原始间充质（肠基质细胞）包裹。

③成熟hPSC来源的肠道类器官（Mat-hIOs）：肠道干细胞表达嗅素蛋白4（OFLM4+），潘氏细胞表达防御素α5（DEFA5+），杯状细胞表达黏蛋白13（MUC13+）。此外，角蛋白20（KRT20）在隐窝的成熟上皮中表达。

注：肠道上皮细胞中，LGR5阳性或ASCL2阳性肠道干细胞、Ki67阳性且LGR5阴性过渡扩增细胞、碱性磷酸酶（ALPI+）/绒毛蛋白（Villin+）/肠脂肪酸结合蛋白（IFABP+）肠上皮细胞、MUC2阳性杯状细胞、溶菌酶（LYZ+）/基质金属蛋白酶7（MMP7+）潘氏细胞及嗜铬粒蛋白A（CHGA+）肠内分泌细胞的比例均应至少为30%。

3.各项质量控制（QC）指标的检测方法

①形态学：在微分干涉显微镜下观察肠道类器官。类器官大小约为0.2-2mm，呈芽状结构，具有中央管腔和上皮细胞层。

②细胞计数：使用血细胞计数板或细胞计数仪进行细胞计数。将类器官从基质胶中解离后，用4℃磷酸盐缓冲液（PBS）或高级DMEM/F12培养基冲洗。用乙二胺四乙酸（EDTA）分散细胞，用高级DMEM/F12洗涤2次，然后用血细胞计数板或细胞计数仪计数。

③多种细胞类型（免疫细胞化学和免疫荧光染色）：用4%多聚甲醛（PFA）固定肠道类器官。将完整类器官或切片（冷冻或石蜡包埋）用0.1%TritonX-100透化15min。随后用4%牛血清白蛋白（BSA）封闭，依次加入一抗（靶蛋白）和二抗孵育（孵育时间和保存温度根据抗体类型调整）。用DAPI染细胞核，在显微镜下观察样本。计算靶蛋白阳性细胞数（N）与总细胞数（M）的比值，记为X=N/M。

④标志物基因（实时荧光定量PCR）：使用商用RNeasy试剂盒或TRIzol法提取总RNA，然后用商用cDNA合成试剂盒进行逆转录。使用实时荧光定量PCR系统进行qPCR检测（实验组设置3个独立样本）。以商业化的人肠道（小肠或大肠）RNA作为阳性对照，GAPDH作为管家基因对照。通过3次重复实验计算靶基因的平均表达水平。采用2^-ΔΔCT法计算靶基因相对于GAPDH的表达量。

4.器官特异性功能

①ALPI检测：使用商用碱性磷酸酶显色试剂盒或免疫细胞化学法检测。吸去培养类器官的培养基，用等体积PBS洗涤2次，用4%PFA固定。按照试剂盒说明书进行ALPI染色，根据染色强度判断检测结果。

②黏蛋白检测：使用商用AB-PAS或黏蛋白染色试剂盒检测。吸去培养类器官的培养基，用等体积PBS洗涤2次，用4%PFA固定。按照试剂盒说明书进行AB-PAS或黏蛋白染色，根据染色强度判断检测结果。

③吸收功能：肿胀实验

制备含20mM福斯高林和DMSO的培养基，二者添加量均为0.1%（v/v）。将含福斯高林或DMSO的培养基加入类器官中，37℃、CO₂培养箱中处理约10-12h。在显微镜下观察类器官肿胀情况，比较实验组（福斯高林处理）与阴性对照组（DMSO处理）的差异。

5.染色体核型和STR分析

①染色体核型分析：从细胞核中分离染色体，采用特定方法染色后制片。在显微镜下拍摄染色体照片，按拼图法将染色体配对。按1至22号染色体的大小顺序排列，性染色体作为第23对。通过染色体配对分析判断是否存在异常。

②拷贝数变异（CNV）分析：CNV检测可发现染色体核型分析无法检测到的精细DNA拷贝数变异，通常采用染色体微阵列或下一代测序（NGS）技术进行分析。

③STR分析：对不同染色体上的10个不同位点进行STR分析，以确认类器官样本的身份。使用荧光标记引物通过PCR扩增靶DNA，然后用DNA测序仪分析扩增产物。

6.3D细胞活力检测——hASC-IOs（小型类器官）

使用钙黄绿素-AM进行活力检测。在显微镜下观察类器官的大小、形态和状态，计数符合最终要求（直径≥200μm）的类器官。加入钙黄绿素-AM储备液，使其终浓度为0.2μmol/L，37℃孵育60min。在荧光显微镜下（激发光：490nm，发射光：515nm）计数发出绿色荧光的活类器官（直径≥200μm）。

hASC来源类器官的细胞特征与鉴定（案例）

A.第3代培养第3天（左）和第6天（右）hASC来源类器官的明场显微镜图像。

B.苏木精-伊红染色（上）和阿尔辛蓝染色（下）的组织学分析。

C.qRT-PCR检测第0天和第6天hASC来源类器官中LGR5（肠道干细胞）、Ki67（MKI67，增殖细胞）、黏蛋白2（MUC2，杯状细胞）、绒毛蛋白1（VIL1，肠上皮细胞）和嗜铬粒蛋白A（CHGA，肠内分泌细胞）的特异性基因表达。各基因表达均以GAPDH表达为内参进行标准化。

D.分化6天的结肠类器官中MUC2（左，绿色）和VIL（右，绿色）的免疫荧光染色。细胞核用Hoechst染色（蓝色）。

7.3D细胞活力检测——hPSC-IOs（大型类器官）

采用3D细胞活力检测试剂盒评估细胞活力。将类器官培养在不透明的多孔板中，按照试剂盒说明书处理样本。根据样本体积和微组织特征优化实验条件。染色后，用荧光显微镜评估发出荧光的活类器官。

hPSC来源成熟肠道类器官的细胞特征与鉴定(案例)

A.第2代培养第1天（左）和第7天（右）hPSC来源类器官的明场显微镜图像。

B.苏木精-伊红染色（上）和PAS染色（下）的组织学分析。

C.qRT-PCR检测对照组和成熟人肠道类器官中LGR5（肠道干细胞）、VIL1（肠上皮细胞）、CHGA（肠内分泌细胞）、LYZ（潘氏细胞）、KRT20和MUC13（成熟肠道标志物）的特异性基因表达。各基因表达均以GAPDH表达为内参进行标准化。

D.培养7天的hPSC来源成熟肠道类器官中Ki67、VIL、MUC2、CHGA、LYSO、KRT20、MUC13和SI的免疫荧光染色。细胞核用DAPI染色（蓝色）。

8.质量评估结果的监测（批次和定期分析）

①培养与生长：类器官传代比例应至少为1:3。

②微生物检测：藻类、细菌、支原体及病毒检测均应为阴性。

③身份鉴定：STR分析结果应与原代一致。

④一般情况下，相同的质量评估检测需进行2次。

1.储存与保存

储存方案：培养的细胞在37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养。如需长期保存，可储存于液氮（-196℃）或超低温环境中。

注：储存时长需根据稳定性试验确定。

2.冷冻过程

①将肠道类器官从基质胶或BME穹顶中分离，收集至60mm细胞培养皿中。

②用组织切碎器将样本机械切碎。

③收集切碎的类器官，加入1mL4℃PBS，轻轻吹打以去除固体基质胶碎片。

④用1mL含15mMHEPES的4℃DMEM/F12洗涤2次，台式离心机离心收集沉淀。

⑤小心弃去上清，每30-50个类器官碎片加入1mL冷（2℃-8℃）冷冻液重悬沉淀。

⑥用P1000移液管将类器官悬液转移至标记好的冻存管中。

⑦将装有类器官的冻存管放入含异丙醇的冷冻容器中，-80℃放置24h。

⑧将冻存管转移至液氮（-196℃）中长期保存。

3.复苏

①预热（37℃）肠道类器官基础培养基和增殖培养基。

②将冻存管置于37℃水浴中解冻冷冻的类器官。

③当冷冻液变为半液态时，从水浴中取出冻存管，加入1mL基础培养基完成解冻。

④将冻存管中的内容物转移至15mL离心管中，加入基础培养基至10mL。

⑤1250rpm离心5min，小心弃去上清，用100μL增殖培养基重悬沉淀。

⑥用P200移液管加入100μL基质胶，轻轻吹打混匀。

⑦在4孔培养板中，每孔加入45μL类器官悬液形成穹顶，37℃、5%CO₂孵育10min，使基质胶凝固。

⑧基质胶凝固后，额外加入5μL基质胶覆盖穹顶。

⑨加入700μL预热的含10μMY27632的增殖培养基。

⑩24h后，更换为不含Y27632的增殖培养基。