类器官药物筛选操作方法详解！

关键提示：开始筛选前，应确认细胞的肿瘤状态（如通过DNA测序），以确保培养物中维持的是肿瘤细胞（而非正常上皮细胞）。

①在筛选开始前2天，按照之前推文所述方法传代类器官。

患者来源类器官的通用实验操作流程参考！

②用显微镜检查类器官，评估培养物质量，排除培养物污染的可能性后，再开始制备类器官。

③向每孔的培养基中加入1mg/ml分散酶II，用P1000移液器破碎BME液滴。将培养板放回培养箱中孵育40分钟。

④40分钟后，收集孔中的内容物，上下吹打10次以促进BME解体。每收集2ml类器官悬液，加入10mladDMEM/F12+++培养基，用预润的10ml血清移液管重悬，然后离心。

⑤将沉淀重悬于10mladDMEM/F12+++培养基中。

关键提示：若在细胞沉淀上方观察到密度较低、玻璃状的沉淀，说明BME未完全去除。需用冰浴的adDMEM/F12+++培养基重复洗涤，直至BME被完全去除。两次洗涤之间将试管置于冰上10分钟，离心前用10ml血清移液管上下吹打10次。

⑥将沉淀重悬于10mladDMEM/F12+++培养基中，用70μm细胞筛过滤类器官悬液。将过滤后的溶液转移回15ml锥形管中，离心。

⑦将沉淀重悬于adDMEM/F12+++培养基中（体积根据沉淀大小调整，1-10ml），取10μl类器官溶液转移至一次性计数板中。计数类器官，将所需总量的类器官溶液转移至新的15ml锥形管中，离心。

关键提示：取计数样本前，确保类器官溶液充分混匀，溶液中无沉淀结块。这对于计数后准确估算总类器官数量至关重要。为确保类器官沉淀充分重悬，可先用P1000移液器将沉淀重悬于1mladDMEM/F12+++中，再用血清移液管加入剩余体积的adDMEM/F12+++培养基。

⑧将沉淀重悬于含5%（体积分数）BME的完全类器官培养基中。为此，先用P200移液器将沉淀重悬于小体积的5%（体积分数）BME/类器官培养基混合液中，确保沉淀完全重悬，然后加入剩余体积的培养基和BME混合液。

关键提示：使用赛默飞世尔的MultidropCombi试剂分液仪分配类器官，当然也可使用其他类似仪器。

①按照制造商的说明清洗分液仪管路。使用赛默飞系统时，先用MilliQ水冲洗管路，再用70%（体积分数）乙醇溶液冲洗，然后用PBS冲洗一次，最后用干净的50ml锥形管中的PBS再次冲洗。一般来说，装有溶液的干净试管只能使用一次，以防止前一次洗涤步骤的“污染物”带入下一次洗涤液中。“洗涤”定义为每根管路冲洗至少两倍管路体积的液体。用PBS或培养基预润后，不要让管路干燥，因为溶液中的盐分会在管路中形成结晶。

关键提示：使用前应按照制造商的说明校准管路。至少每3个月校准一次，但建议在每次筛选前检查校准是否准确，以最大限度减少检测板的变异。

②用类器官预润管路前，先用冰浴的adDMEM/F12+++培养基冲洗管路至少一次。

③倒置装有类器官悬液的Falcon管，确保类器官溶液均匀分布（若静置不动，类器官会沉到管底）。

④确保溶液均匀分布后，用类器官悬液预润管路，直至溶液完全通过管路。

⑤启动程序，将类器官溶液分配至黑底/透明底超低吸附384孔细胞培养板中。我们的设置为384孔细胞培养板格式，每孔40μl。

关键提示：预润完成后应尽快启动程序，否则类器官会沉到管底，导致在培养板上的分配不均匀。为确保类器官均匀分布，分配过程中可用血清移液管上下吹打类器官储备液，但需注意不要在分液仪管路中引入空气。

故障排除

①若选择GR指标作为活力测量方法，需在第3天测定未处理细胞的细胞活力。为此，除了在筛选板中接种外，还需在另一个单独的板中分配类器官（每孔40μl，至少3孔），并立即使用CellTiter-Glo3D试剂进行读数。保存所得原始数据，用于药物筛选完成后的数据分析。

②类器官分配完成后，用显微镜确认药物筛选板中类器官的均匀分布。建议在实验当天拍摄代表性孔的明场图像。将筛选板置于37℃、5%（体积分数）CO₂的湿润培养箱中培养。

③按照制造商的说明清洗分液仪。使用赛默飞系统时，先排出剩余的类器官悬液，用MilliQ水冲洗，再用1%Micro-90皂液（仪器配套提供）和10%（质量体积比）含氯溶液冲洗，最后用MilliQ水冲洗两次。最后两次冲洗使用单独的装有水的50ml锥形管，以防止前一次洗涤液的“污染物”带入后续洗涤液中。“洗涤”定义为每根管路冲洗至少两倍管路体积的液体。用PBS或培养基预润后，不要让管路干燥，因为溶液中的盐分会在管路中形成结晶。确保彻底清洗，因为管路很容易堵塞。

关键提示：使用TecanD300e数字分液仪添加药物，也可使用其他类似仪器。若需要，可在实验开始前生成药物分布布局，以缩短类器官分配与药物添加之间的时间。

①使用配套软件打开新的板布局（若使用HPd300e，使用对应的d300e软件）。

②选择所需的板类型（384孔细胞培养板），并将额外体积设置为40μl（使用HPd300e时，位于培养板布局右上方；）。

③在程序中添加所有将用于药物筛选的化合物及其相应浓度。

④任何所用药物的储备浓度均不得超过10mM（遵循药物分液仪操作规程）。对于溶于PBS或水的药物，向储备液中添加皂液以确保正确分液。添加适量Tween-20，使储备液中的终浓度为0.3%（体积分数）。

⑤在筛选板布局中放置目标药物的浓度梯度，创建包含药物梯度的筛选布局。包含技术重复（我们建议每板至少三次重复）。

关键提示：不要使用板的外缘孔，因为蒸发可能会产生边缘效应，导致板内结果出现偏差。

关键提示：最佳浓度范围因测试治疗药物而异，需在筛选前确定。请遵循关于浓度数量和范围的指导原则。

⑥在板布局中至少设置三个复孔的阳性对照（1-10μM星形孢菌素）。

⑦完成后，选择所有将纳入筛选的孔以及不暴露于药物但用作阴性对照的孔，点击“归一化”，确保所有孔中的总溶剂体积相等。

关键提示：总孔体积中DMSO的体积分数不得超过1%，PBS/0.3%（体积分数）Tween-20的体积分数不得超过2.5%，根据我们的经验，超过这些浓度会导致细胞死亡。

关键提示：尽量使用高浓度的药物储备液，以减少溶剂溶液的添加量。

关键提示：确保每个板至少有三个孔可用作阴性对照。理想情况下，将这些阴性对照分布在板的不同位置，以防止局部效应影响板的结果。

关键提示：需为溶于DMSO的药物和溶于PBS/Tween-20的药物分别设置阴性对照。或者，可对整个筛选的所有孔同时用两种溶剂进行归一化。但需注意，根据添加体积的不同，这可能会对细胞活力产生负面影响，因此需在筛选前进行测试。

⑧保存程序。

打开药物分液仪，点击“运行”。屏幕将显示所需的药物储备液体积。对于溶于PBS或水的药物，取所需体积并额外增加5%，加入Tween-20至终浓度0.3%。立即使用，剩余储备液丢弃。

关键提示：一旦添加了0.3%Tween-20，不要储存药物储备液，因为长期在皂液存在下储存可能会影响药物效果（例如，我们在使用抗体时注意到了这一点）。因此，每次筛选时都应新鲜向药物储备液中添加皂液，且仅配制该次筛选所需的药物储备液体积。

⑨所有储备液融化并准备就绪（必要时添加Tween-20）后，运行程序（点击“开始”），将药物分配至类器官板中。

⑩完成后，将培养板置于37℃、5%（体积分数）CO₂的湿润培养箱中。程序完成后会自动生成.xls格式的报告文件，其中包含所有分配药物的信息（包括分配浓度），可用于数据分析。

关键提示：药物孵育期间尽量避免打开培养箱，以确保药物筛选板处于最佳条件（例如，使用单独的培养箱放置这些板，不用于“常规”组织培养）。不要堆叠药物筛选板，应将所有板单层放置在培养箱架子的底部和后部，以保持不同板之间的条件尽可能恒定和可比。

注意：涉及γ射线照射仪等放射源的研究可能需要事先获得批准，且必须遵守所有相关机构和政府法规。

关键提示：放疗通常在向筛选板中加入化疗药物后的第二天进行。在放化疗联合治疗中，化疗药物充当放射增敏剂，因此应增强放疗对细胞的作用。为将这一点转化为体外检测，我们在应用放疗前先进行24小时的化疗孵育。对于我们测试的药物（顺铂、卡铂和西妥昔单抗）与放疗的联合，24小时的孵育时间效果良好。对于其他目标药物，可能需要调整该时间窗口。

①将放射机设置为所需的辐射剂量（例如，与化疗联合时为2Gy）。

②用封口膜覆盖板的边缘，以防止水进入培养板。最好使用Breathe-Easy密封膜覆盖板，若使用该密封膜，则无需封口膜。

③将用封口膜包裹的板转移至装有室温自来水的盒子中。水位应尽可能高，但不要没过板。此步骤中，密封膜非常方便，因为它们提供了另一层屏障，防止水进入板孔。

④将盒子置于放射束下方，确保光束对准培养板的中心。

⑤离开房间，对板进行照射。

关键提示：一次只照射一个板，不要堆叠板进行照射，因为无法确保辐射的均匀分布。

⑥去除封口膜，用纸巾擦干培养板。将板放回培养箱中，直至读数当天。

①将CellTiter-Glo3D试剂置于37℃水浴中解冻15分钟（直至完全融化）。尽量避免CellTiter-Glo3D试剂的反复冻融，例如，可将试剂分装为每次一块板的用量。

②使用分液仪（与分配类器官所用仪器相同）向药物筛选板的每孔中加入40μlCellTiter-Glo3D试剂。

关键提示：CellTiter-Glo3D试剂会裂解细胞，因此若读数包含图像采集，应在加入CellTiter-Glo3D试剂前完成。拍摄代表性孔（对照、目标药物）的明场图像。

③使用分液仪振荡板5分钟。

关键提示：由于384孔细胞培养板的面积较小，普通板振荡器无法实现孔内内容物的混匀，因此需要使用适配该板格式的振荡器。

④将检测板在室温下孵育15分钟。

通过测量每个孔的发光强度进行读数。使用TecanSpark多模式微孔板读数仪，当然也可使用其他类似仪器。每孔发光检测时间为500毫秒。若信号较低，可延长检测时间。

注意，若同一板中不同药物使用了不同的归一化试剂，应使用相应的阴性对照。

1.在 Microsoft Excel 中收集原始发光检测数据和药物筛选布局。

2.计算药物筛选板阴性和阳性对照孔的平均发光值。

3.使用以下公式计算每个药物筛选板的Z因子：

Z因子表示板内的技术噪声与阳性和阴性对照之间所得总数值范围的比值，因此可作为筛选质量的指标。一般来说，只有当所得Z因子>0.4时，才使用该数据。类器官筛选的Z因子通常≥0.7。

4.将阳性对照的活力设为0%，阴性（仅溶剂）对照的活力设为100%，按以下公式计算每个孔的活力：