新手必学：人源与鼠源不同肠道区段的类器官培养操作详解！

文献建立了一套稳定的三维类器官培养方法，适用于人源和鼠源的小肠及大肠不同区段。系统梳理了各肠道区段的隐窝分离方案、类器官培养方法，以及隐窝形态和生长特性。

1.隐窝分离试剂

①无钙镁离子磷酸盐缓冲液（PBS）；

②0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液；

③70μm细胞筛；

④洗涤缓冲液：汉克斯平衡盐溶液（HBSS），添加0.5mg/mL庆大霉素、2.5μg/mL两性霉素B、100U/mL青霉素（Pen）和100U/mL链霉素（Strep）。

2.类器官培养试剂

①基质胶（Matrigel）；

②基础培养基：高级DMEM/F12培养基，添加1×N2添加剂、1×B27添加剂、10mMGlutaMAX-I、1mMN-乙酰半胱氨酸和100U/mL青霉素-链霉素。

③ENR培养基：基础培养基添加50ng/mL表皮生长因子（EGF）、100ng/mLNoggin蛋白和500ng/mLR-spondin1蛋白（见表）。

3.人源小肠类器官培养

人源小肠类器官培养基（ENR-CASGNP）：ENR培养基添加5μMCHIR99021、500nMA83-01、10μMSB202190、1nM胃泌素、10mM烟酰胺和10nM前列腺素E₂（PGE₂）（见表）。

4.人源大肠类器官培养

人源大肠类器官培养基（ENR-CASGN）：ENR培养基添加5μMCHIR99021、500nMA83-01、10μMSB202190、1nM胃泌素和10mM烟酰胺（见表）

5.小鼠小肠类器官培养：小鼠小肠类器官培养基：ENR培养基

6.小鼠大肠类器官培养

小鼠大肠类器官培养基（ENR-YW）：ENR培养基添加10μMY27632和2.5nMWnt3a蛋白（见表）

7.表格：优化的肠道类器官培养基配方

注："+" 表示添加该试剂，"-" 表示不添加该试剂

图1 人源不同肠道区段的隐窝及培养类器官形态

(a)人源回肠的隐窝-绒毛组分，以及升结肠、乙状结肠和直肠的隐窝组分代表性图像。比例尺：100μm

(b)人源回肠、升结肠、乙状结肠和直肠的隐窝长度测量结果

(c)上述人源不同肠道区段隐窝培养得到的类器官代表性图像。比例尺：100μm

1.人源肠道隐窝分离

①实验开始前，将分装的基质胶置于冰上融化，PBS预冷至4℃。

②将人源肠道样本收集于50mL离心管中，加入含100×青霉素-链霉素的适量基础培养基。

③用洗涤缓冲液反复洗涤人源肠道样本，直至大部分肠腔内容物被清除。

④将肠道样本转移至含10mL预冷PBS的10cm培养皿中；用手术剪和镊子剥离肌肉层和脂肪组织。

⑤将处理后的肠道样本转移至新的含10mL预冷PBS的10cm培养皿中。用盖玻片刮除小肠绒毛，并用预冷PBS冲洗。

⑥将肠道组织剪成3-4mm宽的条带，再进一步剪成3-4mm的组织块。将组织块转移至15mL离心管中，加入10mL预冷PBS和400μL0.5MEDTA溶液。

⑦将离心管置于4℃摇床或旋转仪上孵育30分钟。用手剧烈振荡离心管3次。

⑧将组织块转移至含10mL预冷PBS的10cm培养皿中。用10mL移液管反复吹打组织块10-15次，在光学显微镜下观察是否获得富集的隐窝组分。

⑨将上清液转移至15mL离心管中，4℃、300×g离心3分钟沉淀隐窝。

⑩取1μL隐窝沉淀重悬于含50μL预冷PBS的1.5mLEP管中，用倒置显微镜计数隐窝数量。

2.人源肠道类器官培养

①将隐窝沉淀转移至冰上预冷的1.5mLEP管中。

②加入适量预冷的基质胶（每30μL基质胶含400-500个隐窝），轻轻吹打混匀。

③取20-30μL混合液滴加至24孔板每孔的中央。

④轻轻晃动培养板，使基质胶混合液均匀铺展。

⑤将24孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育约20分钟，使基质胶完全凝固。

⑥人源小肠类器官每孔加入500μLENR-CASGNP培养基；人源大肠类器官每孔加入500μLENR-CASGN培养基。

⑦将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，接种后2-3天即可观察到类器官形成。

图2 小鼠不同肠道区段的隐窝及培养类器官形态

(a)小鼠十二指肠、空肠、回肠、近端结肠、远端结肠和直肠的隐窝组分代表性图像。比例尺：100μm

(b)上述小鼠不同肠道区段的隐窝长度测量结果；

(c)上述小鼠不同肠道区段隐窝培养得到的类器官代表性图像。比例尺：100μm。

1.小鼠肠道隐窝分离

①实验开始前，将分装的基质胶置于冰上融化，PBS预冷至4℃。

②分离小鼠肠道，置于含10mL预冷PBS的10cm培养皿中；用10mL注射器冲洗肠腔，清除内容物。

③将肠道转移至新的含10mL预冷PBS的10cm培养皿中，用手术剪和镊子沿纵向剪开肠腔；用盖玻片刮除小肠绒毛，并用预冷PBS冲洗。

④将肠道组织转移至新的含10mL预冷PBS的10cm培养皿中；用手术剪将肠道组织剪成3-4mm的组织块。

⑤将组织块转移至15mL离心管中，加入10mL预冷PBS和400μL0.5MEDTA溶液。

⑥将离心管置于4℃摇床或旋转仪上孵育30分钟。用手剧烈振荡离心管3次。

⑦将组织块转移至含10mL预冷PBS的10cm培养皿中。用10mL移液管反复吹打组织块10-15次，在光学显微镜下观察是否获得富集的隐窝组分。

⑧将含隐窝的上清液通过70μm细胞筛过滤至10cm培养皿中，去除绒毛组分和组织碎片。

⑨将过滤后的上清液转移至15mL离心管中，4℃、300×g离心3分钟沉淀隐窝。

⑩取1μL隐窝沉淀重悬于含50μL预冷PBS的1.5mLEP管中，用倒置显微镜计数隐窝数量。

2. 小鼠肠道类器官培养

①将隐窝沉淀转移至冰上预冷的1.5mLEP管中。

②加入适量预冷的基质胶（每30μL基质胶含400-500个隐窝），轻轻吹打混匀。

③取20-30μL混合液滴加至24孔板每孔的中央。

④轻轻晃动培养板，使基质胶混合液均匀铺展。

⑤将24孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育约15分钟，使基质胶完全凝固。

⑥小鼠小肠类器官每孔加入500μLENR培养基；小鼠大肠类器官每孔加入500μLENR-YW培养基。

⑦将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，接种后2-3天即可观察到类器官形成。

1.人源样本需在冰上运输；样本可在4℃条件下保存最多24小时，长时间保存会降低类器官的存活率。

2.在与基质胶混合前，可用洗涤缓冲液洗涤隐窝，以防止细菌污染。

3.大肠样本可省略刮除绒毛的步骤。

4.可使用其他浓度的EDTA储备液，调整至终浓度为2mM即可。

5.该步骤可去除残留的绒毛组分，但可能导致隐窝丢失；大肠样本或小块小肠样本可省略此步骤。

6.通常反复吹打10-15次即可获得足够的隐窝。若显微镜下观察到的隐窝数量极少，可重复步骤10和步骤12-13。

7.若隐窝组分完整性良好但上清液中含有大量单细胞，可降低离心速度至150×g、离心2分钟，以去除单细胞。

8.基质胶中的隐窝浓度可根据实验需求调整，但隐窝密度过高会抑制类器官生长。

9.若基质胶在孔中已提前凝固，可省略此步骤。

10.人源大肠隐窝的长度长于人源小肠隐窝（图1a、b）；在本培养体系中，人源大肠类器官的生长速度快于人源小肠类器官（图1c）。

11.人源肠道类器官的首次传代约需7-10天，后续传代约需5-7天。

12.此步骤可使用洗涤缓冲液冲洗，直至大部分肠腔内容物被清除。

13.若细胞筛发生堵塞，可更换新的细胞筛。

14.小鼠十二指肠和空肠的隐窝长度长于回肠，结肠的隐窝长度长于直肠（图2a、b）；在本培养体系中，小鼠小肠类器官的生长速度快于大肠类器官，且十二指肠和空肠来源的类器官生长速度快于回肠来源的类器官（图2c）。

参考文献：

Organoid Culture of Different Intestinal Segments from Human and Mouse Yalong Wang, Ronghui Tan, and Ye-Guang Chen.