Cell Reports Methods｜脑类器官“不够真”？加上微胶质和血管后，胶质瘤放疗反应变了
时间：2026-05-20 阅读：103
写在前面
胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是侵袭性很强的原发性脑肿瘤。尽管手术、放疗和化疗仍是主要治疗方式，肿瘤复发仍然常见。胶质瘤干细胞（glioma stem cells，GSCs）具有较强的侵袭性和治疗抵抗能力，被认为与肿瘤复发密切相关。
GBM 的治疗抵抗并不只由肿瘤细胞本身决定。微胶质细胞（microglia，MG）、肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）、血管结构以及放疗后的微环境重塑，都会影响 GSC 的生长、侵袭和复发。传统二维细胞培养和单纯肿瘤球模型难以还原这些细胞互作；普通脑类器官（cerebral organoids，COs）虽然提供了人源神经组织背景，但多数模型仍缺少免疫和血管成分。
2026 年5月，Cell Reports Methods 发表研究论文 “Human cerebral organoids with microglia and vasculature model glioma stem cell interactions and radiotherapy response”。研究团队通过引入同源人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）来源的双潜能造血/内皮祖细胞，构建了同时含血管样结构和微胶质样细胞的复杂脑类器官（complex cerebral organoids，CCOs）。随后将 CCO 与患者来源 GSC 共培养，用于模拟 GBM 肿瘤生态位及放疗后的肿瘤细胞反应。
本研究把胶质瘤微环境中与治疗抵抗密切相关的两个关键组成部分——血管和微胶质细胞——纳入同一个人源三维模型中。这样的模型更适合观察 GSC 如何与脑内微环境互作，也为后续研究放疗后复发相关过程提供了新的实验体系。
1. 构建含血管样结构和微胶质样细胞的复杂脑类器官
研究团队在脑类器官发育早期引入同源 hiPSC 来源的双潜能造血/内皮祖细胞，使 CCO 在神经组织背景中形成血管样结构，并产生微胶质样细胞。相比普通脑类器官，该模型更接近脑肿瘤微环境所需的细胞组成。
2. 血管样结构具有血脑屏障相关特征并可在体内灌注
CCO 中形成 CD31⁺ 血管样网络，并伴随 collagen IV、S100β、ZO-1 和 PDGFRβ 等血管/血脑屏障相关标志。移植到免疫缺陷小鼠后，这些人源 CD31⁺ 血管样结构可被 FITC-dextran 灌注，并可见周细胞覆盖，显示其具有一定功能化潜力。
3. CCO 中微胶质样细胞具备表型和功能特征
CCO 中出现 Iba1⁺ 微胶质样细胞，并共表达 P2RY12、CD11b、CX3CR1 等微胶质相关标志。Iba1⁺ 细胞内可见 PSD95 信号，结果显示其具有吞噬突触成分的功能特征。
4. CCO/GSC 共培养可重现 GBM 肿瘤生态位关键现象
患者来源 TG16 和 TG20 GSC 接种至 CCO 后，可在类器官组织内形成分散克隆。GSC 与 Iba1⁺ 微胶质样细胞和 CD31⁺ 血管样结构发生空间关联，其中 TG20 细胞呈现血管共选择特征。
5. CCO 的复杂微环境影响放疗后 GSC 反应
经2 Gy 照射后，TG16-GSC 在 CCO 中的生长增强，并上调 SPP1、POSTN、FOSL2、ANXA1 和 CXCL12 等与 GBM 发展和侵袭相关的自然演化特征（natural evolution signature，NES）基因。普通 CO 中未观察到相同程度的变化，说明微胶质和血管成分可能影响放疗后 GSC 的反应。
1. HEC 进入脑类器官后，形成具有血脑屏障相关特征的血管样网络
普通脑类器官主要来源于神经外胚层，能够模拟部分人脑发育过程，但通常缺少血管系统。这对于胶质瘤研究而言很关键，因为 GSC 可沿血管周围空间迁移，也可能利用已有血管结构获得生存和扩增支持。
研究团队采用分步构建策略：先由同一 hiPSC 系分别诱导神经外胚层方向的脑类器官胚状体，以及中胚层来源的双潜能造血/内皮祖细胞（hemogenic endothelial cells，HECs）；随后在早期培养阶段将二者组合，并加入 VEGFA、IL-34 和 GM-CSF 支持血管和微胶质相关细胞发育。该策略让血管和免疫相关细胞在脑类器官发育过程中逐步嵌入组织，而不是后期简单外源混合。
在培养约 50 天后，CCO 中出现大量 CD31⁺ 管状结构，并可延伸至类器官内部区域。collagen IV 信号与 CD31⁺ 结构相邻，说明这些血管样结构周围形成基底膜样成分。多重免疫染色进一步显示，CD31⁺ 结构与 S100β⁺ 细胞相邻，并表达紧密连接相关标志 ZO-1，说明该血管样网络具有部分血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）相关特征。
A-D. 在 500 μm 厚切片（A）和 5 μm 薄切片（B-D）上进行 CD31 免疫染色。A 中展示 CD31 信号的三维重建结果。A 为 PDF01 细胞系来源类器官的放大图，B 为 GM25256 细胞系来源类器官的放大图。C-C’. B 图的局部放大图，显示 CD31 和 collagen IV 免疫染色。D-D’’. 在体外培养第 71 天进行多重免疫染色，检测内皮细胞标志 CD31、星形胶质细胞标志 S100β 以及血脑屏障相关紧密连接标志 ZO-1。结果显示，CD31⁺ 血管样结构与 S100β⁺ 细胞紧密接触，并表达 ZO-1 紧密连接标志。
2. 移植后 CCO 血管样结构可被灌注，并出现周细胞覆盖
仅有 CD31⁺ 管状结构，还不足以说明其具备功能化潜力。研究团队进一步将 CCO 移植到免疫缺陷小鼠体内，观察这些血管样结构是否能够与宿主血管系统发生连接。
移植 1 个月后，经心脏灌注 FITC-dextran，可在 CCO 内观察到被灌注的血管样结构。这些结构同时被人源 CD31 抗体标记，而邻近小鼠血管没有人源 CD31 信号，说明灌注结构来自移植的 CCO。局部图像还显示，宿主血管与 CCO 来源人源血管样结构之间存在连接。
此外，血管样结构周围可见 PDGFRβ⁺ 周细胞样覆盖。结合 Fig.1 中的 collagen IV、S100β 和 ZO-1 结果，CCO 中的血管样结构不仅具有内皮标志物表达，还呈现基底膜、紧密连接、周细胞覆盖和移植后灌注等特征。
A. 将 CCO 皮下移植至小鼠肢体。移植 1 个月后，通过心内灌注 FITC-dextran 标记可灌注血管。B. 在 500 μm 厚切片中，CCO 内部和邻近小鼠血管中均可观察到 FITC-dextran 阳性血管。人源 CD31 免疫染色在邻近小鼠血管中无信号，验证了该抗体对人源血管结构的特异性。B’. 500 μm 厚 CCO 切片中的人源 CD31 免疫染色。C. CD31 免疫染色三维重建显示，CCO 内部存在被 FITC-dextran 灌注的血管腔样结构。D-D’. FITC-dextran 标记小鼠血管，人源 CD31 标记 CCO 来源血管样结构；可见宿主血管与移植物血管之间的吻合连接。E-E’’. 血管样结构周围可见 PDGFRβ⁺ 周细胞覆盖。
3. CCO 中形成具有突触吞噬功能的微胶质样细胞
微胶质细胞是中枢神经系统常驻免疫细胞，也是 GBM 微环境中 TAM 的重要来源之一。普通脑类器官缺少微胶质细胞，会限制其用于研究肿瘤-免疫互作。
CCO 中可见大量 Iba1⁺ 细胞。由于 Iba1 同时可见于巨噬细胞和微胶质细胞，研究团队进一步检测了微胶质相关标志 P2RY12。结果显示，几乎所有 Iba1⁺ 细胞均共表达 P2RY12，说明这些细胞具有微胶质样细胞特征。更重要的是，Iba1⁺ 细胞胞质内可见突触后致密蛋白 95（postsynaptic density protein 95，PSD95）点状信号，说明这些微胶质样细胞能够吞噬突触相关成分。
这部分结果说明，CCO 中的微胶质样细胞不是单纯表达标志物的“背景细胞”，而是具备一定突触吞噬功能。对于后续胶质瘤建模而言，这意味着 CCO 中已经存在可与肿瘤细胞发生相互作用的脑内免疫细胞。
A-B. 在 CCO 的 500 μm 厚切片上进行 CD31 和 Iba1 免疫染色。A’ 为局部放大图。B-B’’. 几乎所有 Iba1⁺ 细胞均共表达微胶质细胞标志 P2RY12。C-C’’. 在 5 μm 薄切片上进行 PSD95 免疫染色。PSD95 信号可见于 βIII-tubulin⁺ 神经元中，同时 Iba1⁺ 细胞内也可观察到神经元 PSD95 的内化信号；C’ 标出了 Iba1⁺ 细胞轮廓。
4. 微胶质样细胞随培养时间延长呈现更成熟的分支形态
除了标志物和功能检测，微胶质样细胞的形态变化也是判断其成熟状态的重要依据。研究团队比较了不同培养时间点 CCO 中 Iba1⁺ 细胞的形态。
培养至 56 天时，Iba1⁺ 细胞突起较短，整体形态相对简单；到 126 天时，Iba1⁺ 细胞突起明显延长，分支更加丰富，形态复杂度增加。
本部分研究结果补充说明了 CCO 中的微胶质样细胞会随培养时间逐渐成熟，对于需要较长时间观察肿瘤-微环境互作的模型而言，微胶质样细胞的持续存在和形态成熟，是模型稳定性的重要基础。
A-B. 在体外培养第 56 天和第 126 天的 CCO 400 μm 厚切片上进行 Iba1 免疫染色。A’’ 和 B’’ 分别为 Iba1 染色的局部放大图。与 56 天相比，126 天时 Iba1⁺ 细胞突起更长，形态复杂度更高。
5. 流式分析进一步确认 CCO 中稳定存在血管和微胶质样细胞群体
免疫荧光可以显示空间分布，但还需要定量验证 CCO 中是否稳定存在血管和微胶质样细胞群体。研究团队将 CCO 解离为单细胞悬液，并通过流式细胞术（FACS）进行分析。
CD31⁺ 内皮细胞可在 CCO 中检测到，而普通 CO 中基本不见这一群体。CD45⁺ 细胞也在 CCO 中显著存在，并表达 CD11b、P2RY12 和 CX3CR1。大多数 CD45⁺ 细胞共表达 CD11b 和 P2RY12，符合诱导微胶质样细胞（induced microglia-like cells，iMG）的特征。
iMG 数量在约 10 周左右达到较高水平，说明培养时间也会影响这些细胞群体；当外源 VEGF、GM-CSF 和 IL-34 撤除后，CD31⁺ 内皮细胞和 CD45⁺CD11b⁺P2RY12⁺ iMG 数量明显下降，说明这些因子对维持血管和微胶质样细胞群体具有重要作用。
这部分结果从定量层面补充了 Fig.1–4 的观察：CCO 不只是局部出现少量血管样结构或 Iba1⁺ 细胞，而是形成了可被流式检测到的内皮细胞和微胶质样细胞群体。
A. CD31⁺ 细胞被定义为内皮细胞，A’ 显示不同 iPSC 系来源 CCO 中 CD31⁺ 细胞比例的定量结果。B. 微胶质样细胞位于 CD45⁺ 细胞群中，并表达 CD11b、P2RY12 和 CX3CR1。C. 在两个 iPSC 系来源的 CCO 中，大多数 CD45⁺ 细胞共表达 CD11b 和 P2RY12；但在较晚时间点，当外源性因子被撤除后，这一比例下降。C’. 在存在 GM-CSF、IL-34 和 VEGF 的条件下，CD45⁺CD11b⁺P2RY12⁺ 细胞，即 iMG，可随时间维持；当外源性因子撤除后，两个 iPSC 系来源 CCO 中的 iMG 数量均下降。
6. 患者来源 GSC 在 CCO 中形成与微胶质和血管相关联的 GBM 生态位
在确认 CCO 具备血管样结构和微胶质样细胞后，研究团队进一步将其用于 GBM 建模。实验选用两条患者来源 GSC：TG16 来源于成人 IDH 野生型 GBM，TG20 来源于 IDH 突变 IV 级星形细胞瘤。两类 GSC 均表达干性相关标志 SOX2，其中 TG16 CD44 表达更高，符合间质样特征。
GSC 与 45–60 DIV 的 CCO 共培养 2 天后，研究团队去除未黏附细胞，并继续培养观察。4 周后，TG16 和 TG20 GSC 均可在 CCO 内形成分散克隆，而不是局限于类器官表面。流式定量显示，EGFP⁺ GSC 可从共培养体系中被检测到；TG16 在 CCO 中有更高保留/扩增趋势。
研究团队后续围绕空间关系开展系列实验，GSC 常位于 Iba1⁺ iMG 附近，说明肿瘤细胞和微胶质样细胞在 CCO 中形成局部接触环境。与此同时，TG16 和 TG20 GSC 均可与 CD31⁺ 血管样结构紧密接触，其中 TG20 显示出沿既有血管样结构分布的血管共选择特征。
该模型重现了 GBM 生态位中的几个关键现象：GSC 在脑样组织中存活和扩增，微胶质样细胞靠近肿瘤细胞，肿瘤细胞与血管样结构发生空间互作。相比单纯 GSC 球体或普通脑类器官，CCO/GSC 共培养体系更适合观察肿瘤细胞如何利用脑内微环境支持自身生长。
A-B. TG16-GSC 和 TG20-GSC 与 CCO 共培养 4 周后，在 500 μm 厚切片上检测 EGFP 信号。C. 共培养 28 天后，通过流式细胞术定量 EGFP⁺ GSC。D-E. GSC 可位于 Iba1⁺ 细胞附近。F-G. GSC 与 CD31⁺ 血管样结构紧密接触，局部放大见 F’ 和 G’。TG20 细胞表现出利用既有血管样结构的血管共选择特征。
7. CCO 的复杂微环境改变 TG16-GSC 对低剂量放疗的反应
放疗是 GBM 标准治疗的重要组成部分，临床放疗通常采用 2 Gy 分割剂量，肿瘤边缘区域的 GSC 可能暴露于较低剂量辐射，并在治疗后残留。研究团队因此在 CCO/GSC 共培养体系中引入 2 Gy 照射，观察复杂微环境是否会影响 GSC 的放疗后反应。
实验结果显示，在普通 CO 中，2 Gy 照射并未明显促进 TG16-GSC 增长；而在 CCO 中，照射后 TG16-GSC 生物发光信号增加，说明含血管和微胶质成分的复杂微环境可能改变 GSC 的放疗后反应。该现象在两个不同 hiPSC 系来源的 CCO 中均可观察到。
同时，照射后 CCO 中分选得到的 TG16-GSC 上调了一组与 GBM 发展和侵袭相关的 NES 基因，包括 SPP1、POSTN、FOSL2、ANXA1 和 CXCL12。相比之下，普通 CO 条件下这些基因变化较弱，除 SPP1 外多数并不明显。该结果说明，放疗后 GSC 的状态并不只由肿瘤细胞内在因素决定，周围微胶质和血管成分也可能参与塑造其增殖和侵袭相关表型。
本部分研究结果显示，复杂 CCO 微环境会改变 TG16-GSC 对低剂量照射的反应，并伴随侵袭相关基因上调。
A-B. TG16-GSC 与 CCO 共培养 14 天后接受照射或不照射处理。随后在第 16 天和第 23 天通过荧光素酶生物发光信号检测 GSC 数量；之后解离共培养体系，并通过流式细胞术分选 EGFP⁺ GSC。B-B’. 分别展示 TG16-GSC 与 GM25256 或 PDF01 来源普通 CO / 复杂 CCO 共培养后的生物发光动态变化。C. 分选 EGFP⁺ GSC 后，通过 RT-qPCR 检测一组 NES 相关基因表达。
该研究为 GBM 类器官建模提供了一个更接近脑肿瘤生态位的人源三维体系。传统脑类器官可以模拟部分神经组织发育和肿瘤侵袭过程，但缺少血管和微胶质成分时，很难完整观察 GSC 与脑内微环境之间的互作。CCO 模型将血管样结构和微胶质样细胞纳入同一体系，使胶质瘤研究从单纯观察肿瘤细胞生长，进一步推进到观察肿瘤、免疫和血管之间的空间关系。
本研究体现了脑类器官在放疗反应研究中的应用价值，放疗后的复发并不只取决于肿瘤细胞本身，残留 GSC 如何利用周围血管结构、微胶质样细胞如何被重塑、局部微环境如何影响肿瘤再生长，都可能参与治疗后进展。CCO/GSC 模型提供了一个可操作的人源体外系统，用于研究这类早期变化。
对于类器官领域而言，本文的价值在于强调“关键微环境成分”的重要性。脑肿瘤模型并不是只要有神经组织和肿瘤细胞即可，微胶质和血管成分本身就是肿瘤生态位的重要组成部分。将这些细胞纳入模型，有助于提高类器官在机制研究和药效评价中的解释力。
结语
本研究构建了同时含有血管样结构和微胶质样细胞的复杂脑类器官 CCO，并将其与患者来源 GSC 共培养，用于模拟 GBM 细胞与脑内微环境之间的相互作用。
在该模型中，GSC 可在类器官中生长，并与 Iba1⁺ 微胶质样细胞、CD31⁺ 血管样结构发生空间接触。TG16 和 TG20 两类 GSC 呈现不同的血管互作方式，说明 CCO/GSC 模型可用于观察不同患者来源肿瘤细胞与脑微环境之间的差异。
通过放疗实验进一步显示，2 Gy 照射可在 CCO 条件下促进 TG16-GSC 增长，并伴随 GBM 发展和侵袭相关基因上调。该结果说明，加入微胶质和血管成分后，脑类器官能够更深入地呈现放疗后 GSC 与微环境之间的相互作用。
关于晶莱
