【新手必看】类器官培养与分析的详细方法！

本文提供了类器官生成和评估的全面分步框架，包括组织解离和细胞分离、培养启动、维持、扩增、分化和成熟。此外，还详细介绍了分子和功能评估方法，包括基于标志物的分析、活力测定和冷冻保存策略，以确保类器官系统的可重复性和长期保存。

1.材料

①酶溶液：IV型胶原酶（Sigma-Aldrich）、DispaseII（Sigma-Aldrich）、TrypLEExpress（Gibco），用于上皮组织的酶解离。

②缓冲液和培养基：DMEM/F12（Gibco）、磷酸盐缓冲盐水（PBS；Gibco）、Krebs-Ringer缓冲液。

③筛网：70μm尼龙细胞筛网（Falcon）。

④组织培养板：6孔或24孔板（Corning），需要悬浮培养时使用超低吸附板。

⑤基质胶：生长因子减少型基质胶（Corning）、培养因子混合物。

⑥其他用品：无菌移液器吸头、离心管、用于处理粘性试剂的低吸附移液器吸头，以及用于活力评估的细胞计数板或自动细胞计数器。

2.方法

a)组织取样和储存：从供体器官、组织切除或活检中收集肝脏组织样本，置于无菌PBS/DMEM/William'sE/UW溶液中，冰上保存以在运输过程中维持组织完整性（图1）。需获得相关机构监管机构（IRB）的适当伦理批准，在采集和储存人类组织前可能需要获得知情同意。

b)组织洗涤：用冰预冷的PBS多次冲洗组织，去除血液和其他污染物。确保无残留血液，因为这可能干扰后续的酶细胞消化。

c)组织切碎：使用无菌手术刀或剪刀将组织精细切碎成小块（如1-2mm）。充分切碎组织但避免损伤细胞。

d)机械解离：使用10mL移液管在试管中反复吹打组织进行机械解离。此步骤可溶解细胞团块，促进单细胞悬液的形成。

e)酶消化：在DMEM中混合IV型胶原酶（如Gibco17104019，0.2-2.5mg/mL）、DispaseII（如Gibco17105041，1mg/mL）和/或DNaseI（如Sigma-AldrichDN25，0.1mg/mL）制备酶消化溶液。将切碎的组织置于酶溶液中，37℃孵育30-60分钟，轻轻摇动以促进消化（使用温控摇床或GentleMACS™解离仪）。此步骤可分解细胞外基质，促进单个细胞的释放。

f)过滤：将消化后的组织悬液通过70μm细胞筛网过滤，去除未消化的碎片。确保只有单细胞通过以进行后续处理。

g)离心：4-8℃下300×g离心5-10分钟（如BeckmanCoulterAvantiJ-15R）。离心后弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含0.5-1%白蛋白（人/牛）的新鲜冷PBS中。

h)细胞计数：使用显微镜、血细胞计数板或自动细胞计数器计数细胞数量。

3.附加说明：整个过程中保持无菌条件以避免污染。

①酶解和机械解离方法的选择必须在有效降解基质与保持细胞活力和表面标志物之间取得平衡。IV型胶原酶因其适度的蛋白水解活性和能够有效降解富含胶原蛋白的细胞外基质而不会过度损伤上皮或干细胞，被广泛用于肝脏和胰腺等柔软的实质器官。

②酶消化的持续时间和温度是决定细胞回收率和质量的关键因素。对于肝脏或肠道活检等脆弱组织，较短的消化时间（37℃下30-45分钟）通常能更好地保持细胞活力；而肾脏或肿瘤样本等致密组织可能需要长达60分钟的孵育并轻轻搅拌。过度消化会导致细胞死亡和Lgr5、EpCAM等干细胞标志物的丢失，而消化不足则会导致解离不完全和接种效率低下。因此，同时进行机械吹打以尽量减少酶暴露时间，同时获得均匀的单细胞悬液。

综上所述，受控的酶消化和温和的机械解离相结合，可在保持类器官形成潜能的同时最大限度地提高单细胞回收率。酶活性和暴露时间应始终根据每种组织类型和样本量进行经验优化。

4.胆管细胞类器官工作流程：从组织来源到长期保存。

胆管细胞来源：胆管细胞可从胚胎干细胞（ESCs）、诱导多能干细胞（iPSCs）或成体干细胞（aSCs）获得。

对于组织来源的样本，将组织样本切碎，使用温控摇床或MACS解离仪进行酶解和机械解离。分离和接种：将解离的细胞通过70μm筛网过滤以去除碎片，随后通过MACS或FACS进行分选。将分选后的细胞包埋在基质胶中，接种成圆顶状结构，频繁更换培养基以支持生长和活力。

传代和保存：手动破碎类器官圆顶，离心后重新接种用于进一步扩增，或冷冻保存在液氮中长期储存。类器官可随后解冻用于下游应用，包括实验测试。

接种：将分离的细胞重悬于基质胶中，在预热的12/24孔板中接种成10-33μL的圆顶状。将培养板置于37℃孵育10-15分钟使基质胶凝固。

培养基添加：细胞圆顶凝固后，加入添加了必需生长因子和抑制剂的AdvancedDMEM/F12培养基以支持初始类器官形成，并将培养物置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。

培养基更换：每2-3天更换一次培养基。使用移液器或吸液器小心移除旧培养基，从孔的侧壁缓慢加入新鲜的类器官培养基，以避免干扰和抬起细胞圆顶。

传代：根据形态和生长速率，每7-10天传代一次类器官。可使用移液器机械破碎，或用TrypLEExpress消化（37℃下10分钟）。将类器官转移至15mLFalcon管中，用额外的AdvancedDMEM/F12培养基洗涤类器官。随后进行离心（300×g离心5分钟），重悬细胞并重新包埋于新鲜基质胶中，加入含生长因子的新鲜培养基培养。

注意：类器官通常需要至少传代三次后才能用于下游实验，以确保稳定性和可重复性。

对于胚胎干细胞/诱导多能干细胞向特定细胞系的分化，必须使用谱系特异性分化培养基。可通过qPCR分析评估谱系特异性基因表达来确认分化结果，质谱可用于代谢和蛋白质谱分析，免疫染色可用于可视化谱系特异性标志物。

从iPSC生成胆管样细胞依赖于FGF10和激活素TGF-β信号激活剂，以及进一步增强胆管细胞分化的视黄酸。

1.标志物

为确认特定细胞类型的培养，荧光激活细胞分选（FACS）和磁激活细胞分选（MACS）被广泛用于细胞分离和表征。免疫组织化学和荧光染色以及RT-qPCR也可用于表型验证。

肝细胞：关键标志物包括白蛋白（主要的肝脏特异性蛋白）、肝细胞核因子4α（HNF4α，对肝脏分化和功能至关重要）、细胞色素P4503A4（CYP3A4，代谢活性和药物代谢能力的标志物）以及多药耐药相关蛋白2（MRP2，参与肝脏胆汁分泌的转运蛋白）。

胆管细胞：可通过细胞角蛋白19（CK19）、细胞角蛋白7（CK7）和γ-谷氨酰转移酶（胆管上皮细胞的标志物）的表达来鉴定，EpCAM富集上皮细胞群，Sox9是胆管细胞谱系必需的转录因子。此外，CD133阳性通常用于富集胆管细胞群。

肠道干细胞：常用标志物包括Lgr5（明确的肠道干细胞标志物）和参与肠道隐窝组织和分化的EphB2。

胰腺祖细胞：使用PDX1（对胰腺谱系特化至关重要）、SOX9（调节胰腺祖细胞维持的转录因子）、碳水化合物抗原19-9（胰腺导管上皮标志物）以及用于富集胰腺祖细胞的CD133进行鉴定。

肾单位祖细胞：标志物包括Wilms肿瘤1（肾脏发育的关键调节因子）、配对盒基因2（对肾单位分化至关重要）和SIX同源盒2（在发育过程中维持肾单位祖细胞池）。CD133或CD24染色可用于祖细胞富集和分选。

2.功能评估

除了谱系特异性标志物的鉴定外，功能验证仍是评估类器官生理相关性的关键基准。成熟的肝细胞类器官的特征是能够执行关键的肝脏功能，包括白蛋白分泌、尿素合成和CYP依赖性药物代谢。例如，研究报道在类器官来源的系统中恢复了成人原代人肝细胞（PHH）的形态并增强了功能标志物，证明了可通过IL6或FXR信号调节的脂质代谢和增殖之间的平衡。同样，在脂肪变性模型中基于CRISPR的功能筛选验证了类器官对脂生成通路调节的反应性，并确定了FADS2在脂质通量调节中的作用。

已建立具有小管样网络的极化肝细胞类器官，其含有超过40%的PHH样细胞，并表现出CYP活性和白蛋白分泌。此外，胎儿标志物（如甲胎蛋白）的消失以及成人阶段代谢酶（UGT1A1、ADH）的出现进一步证实了肝脏成熟。这些发现表明，肝细胞类器官不仅表达经典的身份标志物（ALB、HNF4A），还能重现肝脏特异性的代谢和解毒功能。

对于胆管细胞类器官，功能检测通常集中在转运能力、上皮极性和导管结构上。微工程化胆管类器官芯片系统在灌注条件下显示出维持的转运活性、初级纤毛形成和糖萼完整性，模拟了生理性胆汁流动。在整合了透氧支架和微流控技术的先进培养系统中，也证明了胆汁酸转运基因表达增强和活性胆汁转运。

包括单细胞RNA测序和ATAC-seq在内的多组学分析方法进一步将功能成熟与特定的转录和调控网络联系起来。这些数据集表明，类器官的代谢能力（从葡萄糖和脂质代谢到药物解毒）与结构和组成保真度密切相关。

冷冻保存：将类器官重悬于CELLBANKER2/CryoStorCS10或其他冷冻培养基中，浓度为1-2×10⁶个细胞/mL或50-200个类器官/mL。

冷冻：将冻存管置于细胞冷冻容器（MrFrosty、CoolCell或类似容器）中，在-80℃冰箱中降温。为长期保存，24小时内转移至液氮储存罐。

复苏：在37℃水浴中快速解冻冷冻的类器官，重悬于新鲜培养基中，重新包埋于基质胶中，在标准条件下培养扩增。

类器官染色和固定是评估细胞组成、空间排列和结构完整性的必要技术。

两种广泛使用的方法——3D全组织染色和2D切片（石蜡包埋和冷冻包埋）——具有互补的优势。

全组织染色和共聚焦显微镜提供高达200μm的景深，有助于可视化更大的3D结构。

2D切片的优势在于能够显示整个切片的详细细胞形态，并克服较厚样本中光散射带来的挑战。2D切片随后可用于苏木精-伊红染色、免疫组织化学和荧光原位杂交。全组织染色更适合抗体信号检测，而石蜡切片后进行组织学染色更适合精确的细胞形态描绘。