【实验指南】不同类器官培养基、生长因子、关键试剂选择！

本文详细阐述了截至目前最新的类器官高效培养方法学。重点关注肝细胞来源和胆管细胞来源的肝脏类器官，以及肠道、肾脏、胰腺等其他腹腔器官系统。

类器官培养的主要细胞来源有两种类型的干细胞：

①多能干细胞，包括胚胎干细胞（ESC）及其人工诱导的诱导多能干细胞（iPSC）。

②器官特异性成体干细胞（aSC）。这类成体干细胞可从新鲜组织或冷冻组织中分离获得。

对于肝脏类器官而言，新鲜组织来源的成体干细胞具有高活力和功能保真度，能够进行精确的基因操作和生理学研究，可高度模拟体内条件。这些特性使得新鲜组织来源的成体干细胞在个性化医疗和再生治疗中具有特别重要的价值。

类器官的形态、增殖和分化潜能在很大程度上取决于刺激性生长因子和抑制性信号分子之间的动态平衡。在大多数情况下，必须根据视觉形态和增殖动力学对培养基成分进行微调。

①当类器官表现出致密形态且管腔结构减少时，可通过添加R-spondin1和Wnt3a增强Wnt/β-连环蛋白信号传导，以促进干细胞更新和结构稳定性。另一方面，过度出芽或囊性扩张可能表明Wnt信号过度激活，可通过暂时撤去R-spondin或部分降低Wnt3a浓度来平衡。

②增殖速率低下（尤其是肝胆和胰腺类器官）表明有丝分裂通路刺激不足。增加EGF或FGF10的水平可通过驱动ERK和MAPK级联反应恢复增殖能力。

③在肠道和胃类器官中，添加烟酰胺或TGF-β抑制剂A83-01可增强增殖并防止细胞衰老。然而，长期暴露可能会抑制分化并诱导异常形态。因此，建议采用循环添加和撤去的方式以实现长期稳定性。

④应激诱导的分化通路激活可能导致过早分化或凋亡。添加BMP抑制剂Noggin和ROCK抑制剂Y-27632可通过维持上皮极性和干性来防止不必要的分化和凋亡。

⑤在肾脏和胃类器官中，当需要特定谱系分化（如肾单位祖细胞或内分泌细胞）时，部分撤去Noggin或降低EGF浓度可促进谱系特化。

⑥在胆管细胞分化过程中，在初始扩增阶段后依次用激活素A、视黄酸（RA）和FGF10处理，可有效诱导导管祖细胞，这可通过CK19和SRY-box9（SOX9）的上调得到证实。

⑦在肿瘤来源的类器官中，通常排除Wnt激活剂和BMP抑制剂（如Noggin），以更好地保留内在的肿瘤微环境并重现癌症特异性信号依赖性。

⑧调整A83-01和GSK3β抑制剂CHIR99021的浓度，可实现分化的可控诱导，并改善包括脂肪变性和纤维化在内的病理状态建模。

与传统细胞培养系统不同，类器官培养需要细胞外基质（ECM）提供结构支持，ECM由复杂的蛋白质和生长因子混合物组成。

大多数类器官培养方案使用基质胶（Matrigel）作为标准ECM，它是由Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物，该肿瘤富含细胞外基质蛋白。

基质胶主要由层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖组成，还含有EGF、胰岛素样生长因子、FGF和TGF-β等多种生长因子。生长因子减少型基质胶是经过修饰的基质胶版本，其生长因子含量显著降低，可最大限度减少外源性信号的影响，更适合用于对照研究。

类器官培养系统中使用的细胞外基质支架