Nature（IF=48.5）具有代谢功能的肝细胞类器官对小鼠肝脏的再植重建！

本研究首次建立可长期扩增且保留完整代谢功能的人成体肝细胞类器官（HHO），通过Wnt+STAT3双通路激活（关键因子为抑瘤素M，OSM）解决了体外肝细胞“扩增就丢失功能、保功能就无法扩增”的trade-off难题。OSM既能强力驱动增殖，又能阻止胆管化生，维持肝细胞身份。该类器官可在小鼠肝脏内定植重建、形成代谢分区，并完整复现胆汁酸合成、脂质代谢、药物代谢、糖异生、尿素循环等全部核心肝功能。

本研究优化了类器官培养条件，实现了人原代肝细胞的长期扩增与定向成熟分化。所构建的肝细胞类器官无导管化生表型，且展现出与人原代肝细胞相当的代谢功能。对肝细胞代谢的精准体外模拟，开启了功能性类器官医学的新时代。

在TK-NOG肝损伤小鼠中可高效定植、重建人肝组织。

扩增≤1000倍时再植效率与原代肝细胞相当；过度扩增（>10⁶倍）会下降。

移植后形成胆小管结构，并重现肝脏代谢分区：门静脉区：HAL、ASS1阳性；中央静脉区：CYP2E1阳性。

增殖率极低，符合体内成熟肝细胞特征。

a.异种移植实验流程：TK-NOG小鼠接受缬更昔洛韦（ValGCV）处理以清除内源性肝细胞，随后移植人肝细胞类器官或原代肝细胞；每周采集血液样本，8周后收集肝脏组织。

b.人肝细胞类器官异种移植物的代表性苏木精-伊红（H&E）染色（左）和STEM121染色（右）结果，可见小鼠与人肝细胞之间存在清晰边界。21例原代肝细胞异种移植物（5例供体）和104例人肝细胞类器官异种移植物（8例供体）均获得了相似结果。面积定量结果见图2e、h及扩展数据图5c、e、f、i。

c~h.2例供体来源原代肝细胞和人肝细胞类器官的再植情况。c、f为随时间变化的血清人白蛋白浓度，不同传代次数的人肝细胞类器官以不同颜色标注；“x”代表小鼠死亡。d、g为PY53和PY30供体来源人肝细胞类器官异种移植物的STEM121染色结果。e、h为再植效率，以人肝细胞面积占肝脏总面积的比例计算，每个点代表1只小鼠。采用单因素方差分析（ANOVA），并以Dunnett检验进行组间比较（对照组为原代肝细胞组），*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

i.人肝细胞类器官异种移植物的染色结果：人白蛋白（hALB，红色）、闭合蛋白（occludin，绿色）、人MRP2（蓝色）。1例供体来源原代肝细胞、3例供体来源扩增人肝细胞类器官（eHHO）均获得了相似结果。定量结果见扩展数据图5m。

j.人肝细胞类器官异种移植物的分区标志物染色结果：门静脉区附近的HAL（红色，上图）、中央静脉区附近的CYP2E1（红色，下图）；细胞核采用Hoechst33342染色（白色），植入细胞为STEM121阳性（绿色）。虚线勾勒出门静脉和中央静脉管腔（*标注门静脉）。2例供体来源原代肝细胞、6例供体来源扩增人肝细胞类器官（HAL染色）、8例供体来源扩增人肝细胞类器官（CYP2E1染色）均获得了相似结果。定量结果见图k（HAL）和图l（CYP2E1）。

k、l.STEM121阳性区域内HAL阳性（k）或CYP2E1阳性（l）面积的占比。每个点代表1只小鼠的1张组织切片，每组2~3只小鼠取均值。采用Welch双侧t检验

a.PM11供体来源人肝细胞类器官异种移植后，小鼠血清中人白蛋白的浓度。不同传代次数的人肝细胞类器官以不同颜色标注，n代表分析的小鼠数量。

b.PM11供体来源人肝细胞类器官异种移植物的STEM121染色结果。比例尺：1mm。定量结果见扩展数据图5c。

c.PM11供体来源原代肝细胞和不同培养时长扩增型人肝细胞类器官的再植效率。每个点代表1只小鼠。采用单因素方差分析，以Dunnett检验与原代肝细胞对照组进行比较。

d.PM16供体来源人肝细胞类器官异种移植后，小鼠血清中人白蛋白的浓度。不同传代次数的人肝细胞类器官以不同颜色标注。

e.PM16供体来源原代肝细胞和不同培养时长扩增型人肝细胞类器官的再植效率。每个点代表1只小鼠。采用单因素方差分析，以Dunnett检验与原代肝细胞对照组进行比较。

f.PM10、PY9、PY12供体来源的扩增型、分化型、dHHO+WR人肝细胞类器官的再植效率。每个点代表1只小鼠。

g.PY39a供体来源人肝细胞类器官异种移植后，小鼠血清中人白蛋白的浓度。

h.PY39a供体来源人肝细胞类器官异种移植物的STEM121染色结果。比例尺：1mm。定量结果见扩展数据图5i。

i.PY39a供体来源原代肝细胞和不同培养时长扩增型人肝细胞类器官的再植效率。每个点代表1只小鼠。采用单因素方差分析，以Dunnett检验与原代肝细胞对照组进行比较。

j.长期培养后人肝细胞类器官及其亲本原代肝细胞的端粒长度。采用实时荧光定量PCR检测端粒长度，数据来自4例不同供体来源的原代肝细胞和人肝细胞类器官，数据为均值±标准差。

k.小鼠肝脏中STEM121阳性（浅蓝色）人肝细胞类器官异种移植物的Ki67（红色）染色代表性图像。细胞核采用Hoechst33342染色（绿色）。比例尺：20μm。定量结果见扩展数据图5l。

l.异种移植物中再植效率与Ki67阳性细胞百分比的相关性。每个点代表1只小鼠，每只小鼠分析1张组织切片。r为Pearson相关系数，采用双侧t检验，P=0.8801。

m.hMRP2与hALB的面积重叠率（与图2i相关）。每个原代肝细胞或人肝细胞类器官样本分析2~3只小鼠，计算hALB+面积与hMRP2+面积的比值。每个点代表均值比例，每只小鼠分析1张组织切片。

n.门静脉-中央静脉区域异种移植物的门静脉区标志物ASS1和STEM121染色代表性图像。细胞核采用Hoechst33342染色。比例尺：100μm。虚线勾勒出静脉管腔，*标注门静脉管腔。3例供体样本均获得了相似结果。

o.中央静脉区域的中央静脉标志物GS（红色）、CD31（蓝色）和STEM121（绿色）的代表性免疫染色图像。比例尺：100μm。3例供体样本均获得了相似结果。

1.人肝细胞类器官中的脂质代谢

①分化后形成完整胆小管网络，具备BSEP/MRP2转运功能。

②高表达CYP7A1等限速酶，合成与人一致的结合型胆汁酸。

③可合成甘油三酯，形成脂滴，能模拟脂肪肝（steatosis）。

④可被FXR/FGF19负反馈调控，适用于脂代谢药物筛选。

2.人肝细胞类器官中的药物代谢

①高表达CYP3A4、CYP2E1、CYP1A2等关键药酶。

②具备基础活性+药物诱导活性（利福平、苯巴比妥、奥美拉唑）。

③能精准重现对乙酰氨基酚（APAP）肝毒性，灵敏度远高于传统模型。

④保留Ⅱ相结合反应，是理想的药物代谢与毒理模型。

a.基于转录组测序数据，原代肝细胞、扩增型和分化型人肝细胞类器官中，细胞色素P450介导的药物代谢相关基因的表达情况。

b.上图：基础和药物诱导CYP活性分析的实验流程；下图：原代肝细胞及其来源分化型人肝细胞类器官的2D铺板效率百分比。括号内标注了总培养天数。

c.原代肝细胞和分化型人肝细胞类器官的基础CYP酶活性（与图3j相关）。实验流程见图b，括号内标注了用于CYP诱导的药物。3例供体在不同时间点检测，每个点代表1次实验重复。分化型人肝细胞类器官在2D铺板前，按标注时长进行培养。误差线为均值±标准差：PY12（原代肝细胞n=5，分化型类器官n=5，4个条件）、PY30（原代肝细胞n=8，分化型类器官n=5，4个条件）、PY39b（原代肝细胞n=7，2次重复；分化型类器官n=3，2个条件）。

d.原代肝细胞和分化型人肝细胞类器官中药物诱导的CYP活性。数据来自3例不同供体来源的人肝细胞类器官，每个点代表1个复孔，数据为3次重复的均值±标准差。

e.CYP2A6、UGT、SULT介导的香豆素代谢通路。

f.采用LC-MS/MS检测原代肝细胞和分化型人肝细胞类器官中的香豆素代谢产物，展示了未结合和结合衍生物的占比。

g.对乙酰氨基酚处理分化型人肝细胞类器官的剂量-反应曲线。分别通过ATP活性（上图）和乳酸脱氢酶（LDH）释放（下图）检测类器官活力和损伤。误差线为每个条件3个技术重复的均值±标准差。