【五分钟讲实验】WB 一抗 / 二抗选择：核心原则 + 实操技巧！

WB 抗体选择的中心逻辑：一抗看“特异性”，二抗看“匹配性”，两者需围绕实验目的、样本类型、检测方法等选择。

1. 靶点特异性（第一优先级）

① 优先选 WB验证的抗体，厂家说明书明确标注可以做WB。

② 确认靶点序列：选择针对蛋白特异性区域（避免同源蛋白保守序列）的抗体，如磷酸化抗体需标注“位点特异性”（如 p-AKT Ser473）。

③ 验证方式：一看厂家提供的 WB 图，选择条带单一、无杂带的；二看引用文献，已经使用验证。

2. 种属反应性匹配

① 严格匹配样本种属：确认抗体说明书中种属反应性（Reactivity），人源样本选可以做人源靶点的抗体，小鼠样本选小鼠靶点抗体，兔子样本选兔子靶点抗体。

② 跨种属需确认“交叉反应”。

3. 抗体亚型与形式适配

① 多见为兔源/鼠源抗体

a. 单克隆抗体：特异性高、杂带少，适合定量 WB 和磷酸化蛋白检测。

b. 多克隆抗体：灵敏度高、结合多表位，适合低丰度蛋白检测。

② 避免选择仅识别天然构象的抗体（如部分构象表位抗体），WB 样本经 SDS 变性，需选择识别线性表位的抗体。

4. 灵敏度匹配样本丰度

① 高丰度蛋白（如 GAPDH、β-actin）：常规灵敏度抗体即可。

② 低丰度蛋白（如转录因子、磷酸化蛋白）：选高灵敏度抗体（厂家标注“High sensitivity”），或亲和纯化抗体。

5. 实操选择技巧

① 优先选较稳定的品牌：如CST、Abcam，避免无验证数据的小众抗体。

② 磷酸化抗体额外注意：必须选“位点特异性”，且蛋白提取过程需要加磷酸酶抑制剂，避免脱磷酸化导致无条带。

③ 稀释比例参考：以厂家推荐稀释为主，例如1:500-1:2000，可以选择1：1000，低丰度蛋白可降升高浓度至 1:500，高丰度可降低浓度至1:2000，有条件可以通过预实验优化。

④ 对照设置：设置阳性对照（已知表达靶点的样本）、阴性对照（敲除 / 敲低靶点的样本），排除非特异条带。

1. 严格匹配一抗种属 + 亚型

 二抗需针对一抗的种属和 IgG 亚型：

一抗为兔源（Rabbit IgG）→选山羊抗兔 IgG 二抗（Goat anti-Rabbit IgG）；

一抗为鼠源（Mouse IgG）→选山羊抗鼠 IgG 二抗（Goat anti-Mouse IgG）；

若一抗为其他种属（如山羊、大鼠），需对应匹配（如兔抗山羊 IgG）。

避免种属 / 亚型错配，否则无信号或非特异结合。

2. 标记类型适配检测方法

① 常规化学发光 WB（ECL）：选HRP 标记二抗（辣根过氧化物酶），性价比高、灵敏度适中；

② 荧光 WB（近红外检测）：选荧光标记二抗（如 Alexa Fluor 680/790、IRDye 800CW），适合双色定量和低背景检测；

③ 避免标记类型错配（如荧光二抗用于 ECL 检测无信号）。

3. 特异性降低背景干扰

① 优先选亲和纯化二抗，或标注“Minimal cross-reactivity”（最小交叉反应）的二抗，减少与样本内源性蛋白的结合。

② 若样本含血清（如细胞上清），选预吸附二抗（吸附过样本种属血清蛋白），避免血清 IgG 干扰。

③ 适当降低二抗浓度降低背景。

4. 灵敏度匹配实验需求

① 低丰度蛋白：选高灵敏度 HRP 二抗（如增强型 HRP）或荧光二抗（信号更稳定）；

② 高背景样本：选特异性更高的单克隆二抗，或降低二抗浓度。

5. 实操选择技巧 

① 二抗来源选择：优先选山羊源二抗，性价比高；若需多色检测，选不同荧光标记的同一种属二抗。

② 稀释比例优化：HRP 二抗常规 1:5000-1:10000看厂家推荐稀释比例，根据背景和信号强度调整（背景高则降低浓度，信号弱则升高）。

③ 封闭液匹配：二抗为山羊源时，封闭液选5% 脱脂牛奶（常规）或BSA（磷酸化抗体专用，避免牛奶中磷酸化蛋白干扰）；避免封闭液与二抗种属冲突（如兔源二抗不用兔血清封闭）。

④ 二抗对照：设“仅二抗对照”（不加一抗，其余步骤相同），若有条带则为二抗非特异结合，需更换二抗或优化封闭 / 洗涤。

一抗：WB 验证 + 种属匹配 + 特异性优先，低丰度选高灵敏度，磷酸化选位点特异性；

二抗：严格匹配一抗种属/亚型，HRP适配常规WB；

实操：以厂家推荐为基础，通过预实验优化稀释比，必要时设置对照排除干扰。