【五分钟讲实验】Western blot实验六大问题提逐一解读，新手也能避坑！

WesternBlot实验的是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将蛋白质样品按分子量大小分离，将分离的蛋白质转移到固相膜（如NC膜或PVDF膜）上。转移后的蛋白质在膜上以非共价键形式固定，保持其生物学活性并通过与特异性抗体的结合，以达到检测目的蛋白的技术。

WB实验涉及步骤繁杂、周期偏长，各环节操作均与最终结果紧密相关，极易因细节疏漏引发问题，所以要避开实操中的“雷区”。

下面整理了6个最常见的失败案例，每个案例都帮你找清原因、给出解决办法。

案例1：完全没有条带，目标蛋白“消失不见”

1. 可能原因：

①样品制备失败，蛋白降解或未提取出来；

②上样量不足；

③一抗浓度过高、失效（如反复冻融、保存不当）或一抗与目标蛋白不匹配；

④转膜不充分，蛋白没转移到膜上；

⑤显色底物失效；

⑥封闭不完全。

2. 解决方案：

①重新制备样品，全程加抑制剂，低温操作；

②增加上样量（可根据定量结果调整）；

③检查一抗保质期和稀释比例，用阳性对照验证一抗有效性；

④延长转膜时间（大分子蛋白）或提高转膜电流，转膜后用丽春红染色验证；

⑤更换新的显色底物，按说明书要求操作；

⑥加长封闭时间或更换封闭液。

案例2：条带模糊不清，像“蒙了一层雾”

1. 可能原因：

①凝胶浓度不合适，蛋白分离不彻底；

②上样量过多，蛋白过载；

③一抗浓度过高，非特异性结合增加；

④洗膜不充分，残留抗体导致背景干扰；

⑤转膜时蛋白扩散。

2. 解决方案：

①根据目标蛋白分子量调整凝胶浓度；

②减少上样量，保证条带清晰不重叠；

③降低一抗浓度，延长孵育时间（如4℃孵育过夜）；

④增加洗膜次数（每次5-10分钟，共3-5次），确保残留抗体洗净；

⑤转膜时保持低温，缩短转膜时间（避免过度转膜）。

案例3：出现黑色杂斑

1. 可能原因：

①封闭液溶解不完全或存放时间过长，结块残留在膜；

②一抗二抗产生非特异性结合；

③样本表达过低，曝光时间长。

2. 解决方案：

①可过滤封闭液或更换封闭液；

②更换一抗或优化抗体浓度与孵育条件、匹配二抗种属亚型减少二抗孵育时间、强化封闭洗涤流程；

③提高上样量、优化抗体孵育条件增强信号。

案例4：条带出现拖尾，像“彗星”一样

1. 可能原因：

①样品中盐浓度过高，影响电泳效果；

②蛋白发生聚合或降解；

③上样孔有残留样品，导致蛋白扩散；

④凝胶凝固不均匀。

2. 解决方案：

①对样品进行脱盐处理，或减少上样体积；

②重新制备样品，加入新鲜的抑制剂，避免反复冻融；

③上样前清理上样孔，确保样品完全进入凝胶；

④配制凝胶时充分混匀，避免气泡，确保凝固均匀。

案例5：条带两侧深中间浅

1. 可能原因：

①电泳槽缓冲液液面未完全没过凝胶、电泳时电压过高、电极丝与凝胶接触不均导致边缘泳道的电场强度高于中间泳道；

②配胶时搅拌不均APS/TEMED 加入后未及时混匀、凝胶在室温聚合时边缘先凝固；

③抗体孵育液面未能覆盖膜的正反面；

④三明治结构（海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵）边缘的压力大于中间，导致边缘蛋白转膜效率更高，条带更深。

2. 决方案：

①保证缓冲液液面高于凝胶至少1cm；降低电泳电压，检查电极丝是否清洁且与凝胶边缘平行接触；

②配胶时轻柔上下颠倒混匀，避免剧烈搅拌产生气泡，APS和TEMED 现配现用，加入后快速混匀并灌胶；

③确保孵育时抗体液完全覆盖膜的正反面，且液面高度超过膜边缘 1-2cm；

④在三明治结构中可减少一侧的海绵，防止边缘的压力大于中间影响转膜。

案例6：条带出现双带或多带

1. 可能原因：

①一抗特异性差，与样品中其他蛋白交叉反应；

②目标蛋白存在不同的剪切体或异构体；

③样品中存在蛋白二聚体或多聚体；

④一抗浓度过高。

2. 解决方案：

①更换特异性更高的一抗，或用阳性对照验证；

②查阅文献，确认目标蛋白是否存在剪切体/异构体；

③样品制备时加入还原剂（如β-巯基乙醇、DTT），破坏二硫键，避免蛋白聚合；

④降低一抗浓度，优化孵育条件。

WB实验小技巧，提升成功率！

1. 做好对照：每次实验设置阳性对照（已知含目标蛋白的样品）和阴性对照（不含目标蛋白的样品），方便判断实验结果的可靠性。

2. 标记清晰：凝胶、膜的正反面要做好标记，避免转膜、孵育时方向出错。

3. 试剂保存：一抗、二抗、显色底物等关键试剂需按要求低温保存，避免反复冻融，影响活性。

4. 耐心洗膜：洗膜是减少背景的关键，不要图快，确保每次洗膜充分。