【五分钟讲实验】IHC抗体选择时，需要注意抗体同源问题吗？
时间：2025-12-29 阅读：105
大家好！小晶今天想聚焦一个看似基础却常被忽视的关键问题——IHC（免疫组化）实验中的抗体同源问题。作为病理诊断的核心技术，IHC通过同时标记多个靶标揭示肿瘤微环境，但抗体选择失误可能让数据“失真”，最终造成整个实验的失败。
1. IHC技术对抗体特异性的严苛要求
IHC的核心价值在于标记的精准性，通过样本中抗原抗体的特异性结合，最后标记可以标记目标抗原，如图a。若抗体与样本同源（如检测小鼠组织时用小鼠源抗体），内源性免疫球蛋白会与抗体非特异性结合图b，进而引发两大问题：
① 背景信号爆炸：切片呈现“雾状”污染，掩盖真实目标；
② 定量失真：弱化真实信号，造成假阴性漏诊。
2. 抗体同源的三大“隐形杀手”
① 假阳性陷阱：抗体与样本“自家人”结合，可能将正常组织误判为肿瘤浸润区，结果的判断与分析。
② 信号稀释效应：内源性蛋白“抢夺”抗体，导致目标蛋白信号弱化或者分布不均 ，尤其在低表达肿瘤中易漏诊。
③ 数据可靠性崩塌：标记的定量分析依赖干净背景，同源抗体会扭曲细胞亚群比例，削弱微环境研究的可信度。
3. 规避同源问题的三大原则
① 种属匹配策略：
检测人类样本？选小鼠/兔源抗体
检测小鼠模型？选兔/山羊源抗体
避免“同源相认”，确保抗体与样本“不同源”。
② 验证先行：
优先选用经IHC验证的抗体，查看官网的多重标记数据；
设置阴性对照，排除非特异性结合。
③ 浓度优化：
梯度稀释抗体（如1:50-1:500），找到“信号强、背景净”的平衡点；避免“越浓越好”的误区，高浓度反而加剧背景。
4. 案例启示：合理选择的价值
假设我们检测小鼠脑血肿模型中脑组织中的小胶质细胞的标记物IBA-1和和细胞炎症焦亡相关标记物Caspase-1：
错误选择：抗体标记Caspase-1/Iba-1/GFAP，Caspase-1组和山羊抗小鼠二抗对照组，都有表达见图,结果根据对照可以看出二抗可以和小鼠脑组织内源性IgG结合，导致阴性对照阳性表达，这样就无法判断是假阳性或者是抗体的表达。
正确选择：改用兔源抗体，背景干净，Iba-1细胞定位清晰，准确评估小胶质细胞分布已经活化情况，可以准确统计和分析。
小晶总结发言：
每一个实验失败的分析都是一个抽丝剥茧的探索，免疫实验的验证更像是一个推理验证的案例分析，排除所有因素的干扰，得到的结果才是我问探索的真相。所以全方位的考虑设计实验，不管是动物还是试剂或者是任何一个细节，我们都需要考虑到是否影响结果，细节决定成败。
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