科研必备技能：软琼脂克隆形成实验标准操作流程(SOP)详解及常见问题解决方案！

软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞。某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下也能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了其恶性程度。某些细胞(如正常成纤维细胞)在悬浮状态下不能增殖，不适用此法。

1.用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。

2.按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×培养基(含有2×抗生素和20%的胎牛血清)混合后，取1.5mL混合液注入6孔板中(6cm平皿加3ml、10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。

3.取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的培养液调整细胞密度至1×104 cell/mL备用。

4.按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。

5.将培养板置于显微镜下计数克隆数，每个细胞集落含50个或大于50个细胞为1个克隆，克隆形成率=集落数／接种细胞数x100％计算克隆形成率，最后拍照。

1. 在进行软琼脂克隆形成实验时，首先细胞计数要准确，可以重复计数，取平均值。其次在实验的操作过程中，很多步骤可能会引起污染，这个问题一定要注意。

2. 在将细胞悬液和琼脂混合的时候，一定要把握好琼脂的温度，太高时，容易引起部分细胞死亡，太低则容易使局部结块。

3. 关于选择接种多少细胞的问题，太少，结果不准确；太多，计数太麻烦。当然，这还要根据细胞增殖能力或者说恶性程度来决定。当细胞增殖能力非常强时，可选择少接种一些细胞；当细胞增殖能力很弱时，可增加细胞接种数。

4. 配制和铺上下层琼脂层时，动作轻柔，不要产生气泡。