手把手教你做Co-IP：从原理到实操，一份超详细的免疫共沉淀实验指南+避坑要点！

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，简称Co-IP）是一种基于抗体-抗原的特异性结合以及蛋白质-蛋白质相互组作用的原理来研究蛋白质-蛋白质相互作用的技术，其核心是验证两种或者多种蛋白质是否在细胞内或体外形成物理结合的复合物。

① 内源性Co-IP检测细胞本身含有的蛋白A和蛋白B有无互作。

② 外源性Co-IP是将蛋白A和蛋白B在细胞内共表达后，在检测二者有无互作。

1. 实验前准备

① 含抑制剂裂解液的配制：

冰箱中取出裂解液以及蛋白酶抑制剂，冰上融化，现用现配，配制好的含抑制剂裂解液宜放置在冰浴或4℃。如果免疫沉淀的目的蛋白涉及磷酸化修饰或者乙酰化修饰，需要添加磷酸酶抑制剂或去乙酰化酶抑制剂。

② TBS的配制：将TBS (10X)用超纯水水稀释至1X，即为TBS。

③ 磁珠的准备：

由于磁珠储存在特殊保护液中，所以需要在加入样品前适当洗涤。

用移液器轻轻吹打重悬磁珠，按照每500μl样品使用20μl磁珠悬浊液比例，取适量磁珠至一洁净离心管中，加入TBS至最终体积为约0.5ml。说明：如果初始磁珠体积大于0.2ml，可以考虑先直接置于磁力架上分离10秒，去除上清，然后再加入TBS至最终体积为约0.5ml。

用移液器轻轻吹打重悬磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复上述步骤两次。

④ SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)的配制

取适量SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X)用水稀释5倍即为SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)。例如0.2ml SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X)加入0.8ml超纯水，混匀后即为SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)。

2. 蛋白提取

① 组织蛋白提取

取适量组织样本，用生理盐水或者PBS清洗干净，按照10-20毫克组织使用100-200μl的比例加入含抑制剂裂解液，组织破碎震荡仪中破碎裂解。

10,000-14,000×g在4℃离心3-5分钟，取上清，蛋白浓度约为15-25mg/ml。

BCA试剂盒测定蛋白浓度，稀释到统一浓度。

② 细胞蛋白提取

PBS清洗干净的细胞沉淀，按照每50-100万细胞加入100-200μl的比例加入含抑制剂裂解液，超声裂解，冰上30min。

10,000-14,000×g在4℃离心3-5分钟，取上清。

BCA试剂盒测定蛋白浓度，稀释到统一浓度。

3. 抗体与Protein A+G磁珠的结合

① 轻轻吹打重悬磁珠，吸取20ul磁珠用500ul 1×TBS洗净,轻轻吹打,磁力架上放置1min左右，去除上清，重复3次。

② 加入500ul抗体工作液（抗体浓度根据厂家说明来调整，一般为2-5ug/500ul）,并设制IgG组,4℃旋转混合仪过夜孵育。

4. 免疫沉淀

① 抗体-磁珠混合液放置于磁力架上约1min，去除上清，加入TBS轻轻吸打，放置于磁力架上约1min，去除上清。

② 磁珠中加入500ul蛋白提取液，旋转混合仪，室温2h(或4℃过夜)。

③ 磁力架上约1min，去除上清。

④ 洗涤:加入500ul裂解液（或TBS），轻轻吹打，磁力架上放置1min左右，去除上清。

5. 洗脱

① SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法：本方法为变性法，得到的蛋白样品适合SDS-PAGE电泳或Western检测。

磁珠中加入100ul 1×LB，95℃，5min。

磁力架上1min或者12000rmp离心5min，取上清。

② 酸性洗脱法：本方法为非变性法，比较快速高效。洗脱后的蛋白很多情况下能保持原有的生物活性，便于后续分析检测。

每20μl原始磁珠体积，加入100μl Acid Elution Buffer (酸性洗脱液)，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育5分钟。注：孵育时间不宜超过15分钟。

孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中，并立刻加入10μl Neutralization Buffer (中和液)，适当混匀。

③ 多肽竞争洗脱法：如果目的蛋白是标签蛋白，并使用相应的标签抗体进行免疫沉淀，则可使用相应的多肽进行竞争洗脱。本方法为非变性法，洗脱效率高，且洗脱后的蛋白保持原有的生物活性，便于后续分析检测。

3X Flag多肽洗脱液的配制：取适量3X Flag多肽(P9801)溶解于TBS中，使其终浓度为150μg/ml，或稀释5mg/ml的3X Flag多肽溶液(P9801)至150μg/ml。

每20μl原始磁珠体积，加入100μl 3X Flag多肽洗脱液(150μg/ml)，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温摇晃孵育30-60分钟，或4℃孵育1-2小时。为了提高洗脱效率，可延长孵育时间或重复洗脱。

孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中。上清即为洗脱的Flag标签蛋白。

洗脱的Flag标签蛋白置于4℃待用，或者-20℃或-80℃长期保存。

6. WB检测注意事项

① IP的抗体和WB的抗体使用不同种属来源，IP抗体要求较高，最好是单克隆抗体，无杂带。

② 蛋白提取一定要加蛋白酶抑制剂，通常需要细胞房提供至少1*107细胞。

③ 本实验作为定性分析，定量分析结果准确性不强，需WB和ELISA等实验验证辅助。

IgG组：与特异性IP抗体同物种、同亚型的非特异性IgG进行IP操作。

① 排除抗体本身与样品中其他蛋白质的非特异性结合；

② 作为抗体轻重链的参考标记；

③ 验证IP操作的有效性。

1. 注意事项：

① Co-IP依赖抗体的质量，抗体特异性不足会导致假阳性（非靶蛋白结合）或假阴性（无法捕获靶蛋白）。IP的抗体和WB的抗体一般使用不同种属来源，最好是单克隆抗体，抗体亲和力不够会拉不到蛋白，导致最终WB部分IP组无条带。 

② 蛋白提取一定要加蛋白酶抑制剂等，需要提供至少1*107细胞沉淀。

③ 本实验作为定性分析，定量分析结果准确性不强，需要其它实验辅助。

2. 常见问题：

① IP组目的条带偏移问题

高于目的蛋白条带：产生二聚体或者多聚体。

低于目的蛋白条带：蛋白翻译后剪切或者降解。

② 轻重链杂带问题：轻链杂带25KD，重链杂带55KD。