1. TUNEL测定示意图

末端脱氧核苷酸转移酶 （TdT） 与荧光素 （FITC） 标记的 dUTP 反应，在 DNA 链断裂中将尿苷连接到 3′-羟基 （3′OH） 末端。双链 DNA 通过 DAPI 复染，DAPI 嵌入双链 DNA 链之间。

2. 三种主要的 DNA 片段化检测对比

三种主要的 DNA 片段化检测：DNA ladder、Comet assay、TUNEL。

DNA ladder：BP彼此分开，所得的双链 DNA 片段在琼脂糖凝胶中被视为核小体 200 bp 分子量标准。

彗星测定：Comet assay是相同方法的单细胞变体，其中彗星状图像代表死细胞中降解的DNA，而没有彗星的点是由活细胞的DNA形成的。

TUNEL标记整个和片段化细胞核内DNA中的3′OH DNA末端。

与DNA片段化测量的其他两种主要方法（DNA分子量标准和彗星测定）相比，TUNEL的优势在于基于DNA末端而不是片段的鉴定。

3. 不同TUNEL检测模式的说明

通过以上区分几种TUNEL模式。

仅细胞核类型的 TUNEL 模式由轻度损伤产生，而更强的损伤（即暴露升高）会导致细胞核或细胞更强的染色和崩解。

1.  3'-羟基末端脱氧核糖核酸末端不仅在细胞死亡期间由于核酸内切酶作用而发生，而且在几乎所有与 DNA 的酶促反应中都作为正常中间代谢物发生。产生 3'-羟基末端的主要细胞功能是 DNA 合成，其中许多冈崎片段理论上可能产生假阳性 TUNEL 信号，尤其是在测定的高灵敏度修饰中。

举例：在肾损伤期间，由于 AP 核酸内切酶的作用，DNA 修复也可能导致错误的 TUNEL 阳性信号。化学（过氧化氢、博来霉素）或物理（伽马辐照）损伤诱导的大量氧化性肾损伤可能会增加 3′OH 末端的数量，除了核酸内切酶介导的 DNA 片段化外，还会增加假阳性 TUNEL 读数。

2. TdT反应的实验条件（时间、温度、酶活性或辅助因子）设置不当可能导致人为升高的TUNEL阳性信号背景。

3. 某些细胞类型（例如内皮细胞）或肾脏区室（例如肾小球）或病理组织（例如肿瘤）中的 DNase I 活性低。预计这些细胞会显示出低 TUNEL 阳性，不是因为它们具有抗损伤性，而是因为没有足够的核酸内切酶活性来在 TUNEL 中产生可测量的信号。

4. 当DNA片段化量过高时，例如，在细胞死亡的晚期或高强度损伤中，由于双螺旋的分解，剩余的DNA无法用DAPI正确复染，因此会出现TUNEL染色的定量问题。

5. 使用荧光素标记的TUNEL时，存在将组织中的背景自发荧光识别为TUNEL阳性的危险。在这些情况下，建议改用红色谱TUNEL。

参考文献：

TUNEL Assay: A Powerful Tool for Kidney Injury Evaluation.Christopher L. Moore ,Alena V. Savenka，Alexei G. Basnakian.Int. J. Mol. Sci. 2021, 22.