【五分钟讲实验】脑卒中动物模型构建最详说明书！

根据《中国脑卒中防治报告（2023）》，我国40岁及以上人群脑卒中现患人数达1242万，且发病人群呈年轻化。我国平均每10秒就有1人初发或复发脑卒中，每28秒就有1人因脑卒中离世；幸存者中，约75%留下后遗症、40%重度残疾，病患家庭将因此蒙受巨大的经济损失和身心痛苦。

1990年到2017年中国34个省份地区（包括港澳台）居民第一大死亡原因，是中风（脑卒中）！！！

来自：《1990-2017年中国及其各省的死亡率、发病率和危险因素分析》

1. 脑卒中

“脑卒中”（cerebral stroke）又称“中风”、“脑血管意外”（cerebralvascular  accident，CVA）。是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病。

脑卒中一般分为两大类：出血性卒中、缺血性卒中。

出血性脑卒中又称为颅内出血：就是人们常说的脑出血或脑溢血，蛛网膜下腔出血也属于这一类，出血性卒中的原因多为高血压、颅内动脉瘤或血管畸形破裂引起。

缺血性脑卒中又叫脑梗死：因脑部血液循环障碍，血栓阻塞脑血管引起短暂或永久脑血流供应障碍，脑组织缺血缺氧坏死，导致神经功能缺损，产生包括偏瘫、失语、认知和学习能力受损等一系列临床综合征。在所有的卒中病例中，大约87%属于缺血性脑卒中。

2. 出血性脑卒中、缺血性卒中示意图

图片来源于网络

3. 缺血性脑卒中——脑梗死

栓塞性脑梗塞的病因常是血流带进颅内的固体、液体、或气体栓子将某一支脑血管堵塞。其病因很多，主要为心源性与非心源性两类：

① 心源性：急性或亚急性心内膜炎，一般发生在心脏病的基础上。病变的内膜上由于炎症结成赘生物，脱落后随血循入颅发生脑栓塞。诸如风心病、心肌梗塞、先天性心脏病、心脏肿瘤、心脏手术等都易造成栓子脱落。尤其这些心脏病，出现房颤时更易将栓子脱落，均可造成脑栓塞。

② 非心源性：气栓塞、长骨骨折时的脂肪栓塞、肺静脉栓塞、脑静脉栓塞都是非心源性脑栓塞的原因。有的查不到栓子的来源称为来源不明的脑梗塞。         

1. 模型构建方法

为了研究缺血性脑卒中的发病机制，更好地预防和治疗缺血性脑卒中，建立合适的动物模型至关重要。缺血性脑卒中动物模型的常用造模方法:

2. 局灶性缺血性脑卒中——线栓法

1986年，Koizumi等发明了线栓法以制备局灶性脑缺血大鼠模型，基本操作是：

于颈总动脉分叉部或颈外动脉残端插入栓线，栓线相继经过颈内动脉、大脑后动脉、大脑前动脉起始段；栓线在插入过程中与颈内动脉结合，逐渐闭塞颈内动脉血流，引起大脑中动脉供血区缺血、梗死。

先分离并结扎颈外动脉，同时暂时性结扎颈总动脉，将颈内动脉进行分离，剪断颈外动脉，从颈外动脉靠结扎线的远端做切口，插入尼龙线使其经过颈总动脉分叉进入颈内动脉，至有轻微阻力为止，阻断邻近的大脑中动脉所有血供。目前该方法被公认为是局灶性脑缺血模型的标准建立方法，在国内外得到了广泛运用。

线栓法造模的优点在于避免了开颅手术，可控制再灌注时间，便于实验研究。

1. 线栓法制备大脑中动脉栓塞一般研究思路

2. 主要操作步骤

① 颈正中切口，分离周围组织，显微镜下暴露颈总动脉，颈外动脉和颈内动脉；

② 分离颈外、颈内动脉和翼颚动脉，可结扎翼颚动脉，保持颈总动脉的唯一分支颈内动脉的开放；

③ 将包有硅胶的1.5厘米长的6-0尼龙线栓小心地从颈外动脉插入颈内动脉，直至大脑中动脉的起始处，线栓大约插入10±0.5毫米；

④ 若要恢复大脑中动脉的血流，只需把线栓拔出，使头端退到颈外动脉，颈总动脉血流就可以再灌注到中动脉；

⑤ 缝合伤口皮肤，等动物麻醉苏醒后放回笼中即可。

3. MCAO模型案例分享

造模成功率：80%；小鼠梗死时间1h，大鼠梗死时间1.5h；梗死面积25-33%。

3.1 实验材料:

① 设备：麻醉系统或试剂，保温毯；

② 动物：SD大鼠，200-300g之间；

③ 手术器械：备皮刀片、棉签、手术刀、牵开拉钩，眼科手术剪，眼科手术镊子，4-0缝合线，弯三角缝针等。

3.2. 操作：

① 10%的水合氯醛400mg/kg，腹腔注射。大鼠麻醉后，仰卧位置固定手术台，使用保温毯维持体温。

② 浸润大鼠颈部皮毛，备皮长度约3cm，沿颈部中线切开皮肤（切口长度约2cm）暴露胸骨舌骨肌和胸锁乳突肌，在两块肌肉交界处，翻开胸骨舌骨肌即可见跳动的颈总动脉，分离迷走神经，并在颈总动脉下穿4-0缝合线，打活结。

③ 沿着颈总上行分离颈总动脉周围组织，暴露并分离颈内和颈外动脉和分叉点，在颈外动脉下穿4-0缝合线，其中远心端打死结，近心端打活扣，颈内动脉打活结，备用。

④ 用眼科手术剪在打结点和活扣中间剪开一个切口，将带有标记的线栓迅速插入切口，用活扣固定线栓。左手轻轻牵动远心端节点，使颈外和颈内的血管近直线，右手牵动固定线栓的活扣，将其翻折进到颈内动脉，解开颈内动脉的活结，将线栓缓缓推进颈内动脉。颈内和颈外的分叉点距离线栓标记1-2mm，拉紧颈外的活扣固定线栓，打开颈总的活结。

⑤ 大概0.5-1h后，进行再灌注。清醒状态下，轻轻抽出线栓。当感到明显阻力消失时候，表明头端已经抽出颈内动脉进入颈外动脉残端，剪断血管外线栓。

4. 线栓法模型评价

模型争议点：

一般模型构建初期海马区不会发生梗死，造模8周后记忆类行为学改变。

1. FeCl3 致血栓形成法一般研究思路

线栓法模型比较可靠，形成的脑梗死面积比较固定，是目前研究脑缺血普遍使用的模型，但线栓法无法完全模拟病理生理过程。

因此选用最新的氯化铁(FeCI3)诱导大脑中动脉远端血栓模型，可模拟脑血管内血栓形成，有利于溶栓药物研究。

2. 模型原理：

① FeCl3损伤局部大脑中动脉血管内皮，使血管内膜脱落，进而激活血小板，导致局部血栓形成，最终大脑中动脉供血区出现梗塞。

② 此模型出现的神经症状、脑梗死范围等指标与线栓法致大脑中动脉栓塞模型基本接近。

③ 造模成功率：90%。梗死面积：15-20%。

3.FeCl3 致血栓形成法案例分享

备皮-暴露颅骨-剔除中动脉上部的肌肉-暴露中动脉-造模

麻醉后暴露大脑中动脉（位于嗅束及大脑下静脉之间），将吸有50% FeCl3溶液10 μL的小片定量滤纸敷在大脑中动脉上约30 min，待大脑中动脉凝闭，取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。

4. 模型评价

① 神经功能评分细则

②激光散斑

5. 设备

① 瑞沃德 RFLSI Ⅲ ：激光散斑血流成像系统

可实时监测、并直观地呈现活体器官组织微循环血流灌注量分布情况；

快速获取高分辨率图片、数据、视频等多维度的结果，客观量化微循环血流量数据。

② DREAM-SDV：颅骨钻

大鼠脑部激光散斑前需要进行磨骨。

晶莱生物为研发者提供脑卒中、栓塞性脑梗死、脑出血、脑损伤、脊髓损伤、帕金森、老年痴呆、应激等多种神经系统疾病动物模型服务，可直接用于神经疾病相关研究。