国自然热点“铁死亡”之 长链非编码RNA NEAT1作为ceRNA通过调节miR-362-3p/MIOX轴促进铁死亡

Long noncoding RNA NEAT1 promotes ferroptosis by modulating the miR-362-3p/MIOX axis as a ceRNA

长链非编码RNA NEAT1作为ceRNA通过调节miR-362-3p/MIOX轴促进铁死亡

期刊：Cell Death & Differentiation          

发表时间：2022-03-25      

影响因子：12.067

长非编码RNA（LncRNA）是一类长度超过200nt的RNA，LncRNA可以像海绵一样，作为竞争性内源RNA (ceRNA)吸附miRNA，以减少miRNA对其靶mRNA的调节（作用机制）。LncRNA NEAT1 有2个转录本NEAT1_1(3.7 kb)和NEAT1_2 (23 kb)，在多种人类肿瘤中高表达，参与肿瘤细胞增殖、迁移、周期和凋亡的调控，从而促进肿瘤发展并与肿瘤患者预后不良相关。

铁死亡（Ferroptosis）是一种由铁依赖的脂质过氧化诱导的新型调节性细胞死亡，在肿瘤的发生和耐药中起着重要作用，近年来，越来越多的研究发现LncRNA参与了细胞铁死亡。

肌醇加氧酶（Myo-inositol oxygenase，MIOX）是一种33kDa的非血红素铁蛋白，通过葡萄糖醛酸-木糖途径将肌醇代谢为D-葡萄糖醛酸。MIOX上调促进ROS的产生，减少烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和谷胱甘肽(GSH)，导致细胞抗氧化能力下降。

a. HepG2细胞RNA-seq；

b. 重叠基因列表；

c. UALCAN数据库分析；

d. HepG2细胞中5个lncRNAs的读取计数；

e. NEAT1基因亚型及p53结合位点示意图；

f. 诱导剂促进NEAT1基因mRNA表达。

1.2 erastin和RSL3诱导的NEAT1表达由p53介导

g、h. 干扰p53后，NEAT1的mRNA表达未受到影响；

i. ChIP-qPCR：p53显著富集；

j. 荧光素酶报告基因：诱导剂增加了NEAT1野生型启动子活性。

2. NEAT1促进erastin和RSL3诱导的铁死亡

a. shRNA干扰位置图；

b. Northern Blot检测干扰稳转株中NEAT1两个转录本的表达；

c. CCK-8：敲降NEAT1能抑制erastin和RSL3诱导的铁死亡。

d. 酶标法检测MDA；

e. 流式检测脂质ROS；

f. 酶标法检测Fe2+。

敲降NEAT1显著抑制了MDA、ROS和Fe2+的积累。

MDA（丙二醛）是脂质ROS的终产物，铁死亡的关键：Fe2+和脂质ROS。

3.NEAT1通过调节MIOX的表达来调控铁死亡

a、b. RNA-seq分析：敲降NEAT1后，599个上调、711个下调基因对Erastin无反应；

c. 火山图：反映a和b中NEAT1调节的差异表达基因。6个上调，15个下调；

d. qPCR：诱导剂无法诱导NEAT1敲降的细胞中MIOX的上调；

铁死亡诱导的MIOX表达依赖于NEAT1。

e. CCK-8：MIOX的过表达挽救了由NEAT1干扰抑制的铁死亡；

f-h. MDA、ROS和Fe2+检测。

4. MIOX通过调节Fe2+, GSH和NADPH促进铁死亡

a. CCK-8：MIOX的过表达促进了erastin和RSL3诱导的铁死亡；

b-d. Fe2+, GSH和NADPH检测。

GSH：抗氧化剂，清除胞内脂质H2O2，防止铁死亡；

NADPH：有助于消除脂质ROS，调节细胞对铁死亡的敏感性。

铁死亡诱导剂：

Erastin：半胱氨酸↓，GSH↓，ROS↑

RSL3：结合GPX4活性位点

e. CCK-8：敲降MIOX抑制了erastin和RSL3诱导的铁死亡；

f-h. Fe2+, GSH和NADPH检测；

i. MIOX调节铁死亡的机制示意图。

5.1 MiR-362-3p参与NEAT1对MIOX的调节

a. 预测工具：在NEAT1中寻找潜在的miRNA结合位点；

b. 预测工具：在MIOX中寻找潜在的miRNA结合位点；

c. 预测结果比对：筛选出了唯一重叠的miR-362-3p；

d. 序列比对：NEAT1、MIOX、miR-362-3p；

e. WT和MUT示意图。

5.2 MiR-362-3p与NEAT1和MIOX相互作用

f、g. qPCR：敲降or过表达NEAT1会增加or降低miR-362-3p的表达；

h. 荧光素酶报告基因实验：miR-362-3p的过表达显著抑制野生型NEAT1的转录活性；

i. 荧光素酶报告基因实验：miR-362-3p对MIOX-3’UTR的活性可以通过NEAT1过表达而部分恢复。

j. qPCR+WB：干扰miR-362-3p显著增加了由NEAT1敲降导致的MIOX表达的下调；

k. qPCR+WB：miR-362-3p的过表达显著抑制了由NEAT1诱导的MIOX的表达；

l、m. RIP：Ago2-miR-362-3p复合物降低的MIOX mRNA水平在NEAT1缺失的HepG2中显著富集。

miRNA以Ago2依赖的方式抑制mRNA翻译；

MIOX和miR-362-3p之间的相互作用受NEAT1表达水平的影响。

6. MiR-362-3p通过调节MIOX抑制铁死亡

a. CCK-8：过表达miR-362-3p能降低MIOX所导致的促进细胞死亡作用；

b-d. MDA、ROS、Fe2+检测：过表达MIOX后，得到恢复；

e、f. GSH和NADPH检测：MIOX过表达抑制了由miR-362-3p诱导的GSH和NADPH水平。

g. CCK-8：下调miR-362-3p显著促进了铁死亡，而MIOX的敲降抑制了由miR-362-3p下调导致的铁死亡；

h-j. MDA、ROS、Fe2+检测：下调miR-362-3p显著促进MDA、ROS、Fe2+的积累；

k、l. GSH和NADPH检测。

7. NEAT1过表达促进erastin或RSL3在体内外诱导的铁死亡

a. 克隆形成：慢病毒构建稳转株；NEAT1过表达增加了erastin和RSL3诱导的铁死亡；

b、c. 皮下移植细胞+腹腔注射小鼠erastin或RSL3；

d、e. MDA、GSH检测。

f.免疫组化和原位杂交染色。

4-HNE是一种氧化应激标志物，脂质过氧化的主要产物，ROS激活脂质氧化，从而产生4-HNE。