【5分钟讲实验】流式细胞周期检测的那些问题

1、根据不同的检测细胞调整合适的温度、湿度、酸碱度等培养环境，注意一定要无菌的环境培养。

2、培养细胞时，以对数期处理为宜，避免细胞量过少导致收集细胞量不足或者细胞量过多导致细胞开始大量死亡造成的实验误差。

3、流式检测细胞周期上机检测所需收集细胞量较多，收集细胞时尽量多收集一些

4、流式检测对细胞离心，重悬次数较多，注意动作轻缓，避免过多地损伤、弄破细胞。

5、本实验对细胞离心，重悬次数较多，注意动作轻缓，避免过多地损伤细胞。

6、细胞周期待测细胞尽量要获得单个细胞，避免DNA的降解。

7、样本最关键的就是减少碎片(EDTA/不可过度吹打/离心rpm)。PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase降解。PI质量及RNase所加量很重要，建议用商品化试剂。

8、污染脱氧核糖核酸酶会降解DNA，故玻璃器皿和试剂要干净灭菌。

9、染液等物质有一定毒性，注意防护。

1、固定时必须预冷PBS重悬打入无水乙醇中，做到随加随混匀，避免细胞形成团块。

2、固定后细胞虽然可以保存较长时间后再上机检测，为避免不可控因素影响最好尽早上机检测。

3、进样速度：一般检测细胞浓度调整为2*10^5到2*10^6/ml，建议进样速度为低速。若峰形较宽、CV较大，可能就是进样速度太快。

4、仪器质控定期做，检查质控微球的CV值，尽可能排除因机器设置引起的峰形加宽。

5、通过电压脉冲信号的宽度、高度、面积等参数区别实体组织标本中的粘连细胞群体，最大程度的减少粘连细胞带来的假阳性结果。

6、选择合适的细胞系，不同的细胞系由于细胞形态、直径等不同，会对结果的美观程度有一定的影响，笔者常用HeLa细胞系，峰形较细，周期各阶段明显区别，结果美观。

7、建议选择6孔板操作，细胞给药密度在40%左右，给药时间不一定要与蛋白印迹法给药时间一致。这是由于蛋白印迹法检测的是蛋白表达的变化，例如给药10小时，蛋白上可见明显变化趋势，但10小时收样时，孔内细胞已经明显观察到细胞漂浮凋亡，那对流式检测的结果会有很大的影响。流式细胞术收样时，尽量保证孔内细胞还未漂浮。

8、收样时，如果孔内已经有细胞漂浮，细胞上清悬浮液也要收集。建议选用胰酶消化，消化时间必须严格控制，及时终止消化，消化时间太久，容易对细胞造成损伤和死亡。

9、收集细胞时，离心机选用4℃，300-500g离心5分钟，小心吸去上清。加入0.3 mL预冷的PBS，将管内的细胞混匀后，再加入0.7 mL预冷的无水乙醇，4℃固定过夜。整个收样过程中，不要用枪头剧烈吹打细胞，一是会损伤细胞，二是造成细胞损失。

10、上机前，离心机选用4℃，300-500g离心5分钟，弃去上清。此时格外需要注意的是由于不同时期细胞的重量不一样，离心后细胞不是全部沉淀在管底，管壁上也会存在大量细胞，去上清一定要注意。加入100 μg/mL的PI染色液，避光染色15分钟以上，上机测试前最好使用200目筛网过筛，以免细胞聚集堵塞机器管道。