【5分钟讲透实验】如何做出准确可靠的细胞划痕结果

细胞划痕实验（Cell scratch assay）是通过在细胞单层上划痕并通过延时显微镜定期捕获图像，从而研究细胞迁移运动、修复能力和细胞间相互作用的实验室技术。

在进行细胞划痕实验前，需要准备足够数量的细胞，并将其培养至适当的状态。细胞的生长环境、密度和新鲜度等因素都会影响实验结果，因此在细胞培养过程中需要严格控制这些因素。

1. 细胞的选取：

通常永生化的细胞系和原代细胞常用作这方面的模型，如角质形成细胞和成纤维细胞。避免选取生长特别缓慢的、贴壁十分不牢固的或者堆积生长的细胞。

2. 细胞状态：

在进行细胞划痕实验前，需要确保细胞处于适当状态。例如，在进行细胞迁移实验时，需要将细胞培养至密集和平稳的单层，以使划痕后的细胞迁移能够更为明显。同时，在进行细胞增殖实验时，需要选择具有相似生长率的细胞，以排除因生长速度差异引起的影响。

3. 细胞培养的密度：

划痕实验一般是几种细胞的结合，但是每种细胞的生长速度会不一样，所以需要按照细胞的生长特性调整培养密度，当细胞密度过低时，可能会对细胞迁移和增殖产生不利影响，而当细胞密度过高时，则可能导致细胞之间的相互作用和干扰。因此，在进行细胞划痕实验前，需要合理控制细胞密度，并根据实验目的和要求进行调整。

4. 细胞基质：

细胞基质是指培养细胞所在的支架或基底物，可以对细胞划痕实验产生一定的影响。例如，不同种类和性质的基质可能会对细胞迁移和增殖产生不同程度的影响。因此，在进行细胞划痕实验时，需要选择合适的基质，并对其进行优化和调整。

5. 细胞培养方式：

细胞培养方式一定要改成无血清或者低血清的培养基。细胞划痕实验意指细胞迁移而不是细胞增殖，因此需要将细胞增殖的影响降到最低。但若细胞改成无血清培养后大面积漂浮，需要适量加入血清浓度不能高于2%。当然，一定程度上无血清培养可以忽略细胞增殖的影响，但由于细胞内信号传递的负面影响，细胞迁移的速度也会慢很多。

培养环境要求37℃、5% 二氧化碳的培养箱，选取合适的时间点取样拍照。可按0h，10h，12h，15h时间点取样，拍照(具体时间依实验需要而定)。

6. 实验温度和湿度：

在进行细胞划痕实验时，需要保持合适的实验温度和湿度，以确保细胞生长环境的稳定和可靠。通常情况下，温度应保持在37℃左右，湿度应保持在50%-70%之间。

7. 实验器具：

细胞划痕实验需要使用一些特殊的仪器和耗材，如细胞培养皿、细胞刮刀、显微镜等。在使用这些器具时，需要保证其干净、无菌并经过适当处理，以避免任何污染或干扰实验结果。

铺细胞最好使用6孔板，因为6孔板可以保证有相当距离的平直划痕，而且因为有5条定位线，与划痕相交，这样就有10个可固定监测点，不作重复，误差也很小。

8. 细胞处理：

细胞在实验过程中可能会受到不同的处理，如添加特定药物、激素或细胞因子等。这些处理可能会影响细胞的迁移能力和活性，因此需要对其进行适当的处理和控制，以避免干扰实验结果。

9. 划痕的长度、位置和重复性：

细胞划痕的长度、位置和重复性都会影响实验结果的可靠性和精确性。因此，在进行细胞划痕实验时，需要在划痕的长度、位置和重复性方面进行准确控制，并对实验过程中可能存在的误差和变异因素进行适当考虑。

10. 刮伤力度：

细胞划痕实验中，刮伤力度直接影响细胞迁移结果。如果划痕过深或太浅，都会影响结果的准确性。因此，在操作时要保证刮伤力度一致、不过深，尽量避免损伤到底部的基质。

11. 观察时间点：

细胞划痕实验中，观察时间点的选择也很重要，对于不同的细胞类型和实验目的，最佳的观察时间点也不同。通常情况下，观察时间点可以设置为划痕后24小时、48小时或72小时等。

如果连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素（1μg/ml）处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。另外，使用无血清培养基也可以降低增殖对实验结果的影响。

12. 避免气泡：

在进行细胞划痕实验时，需要尽量避免培养皿中出现气泡。气泡的存在可能会干扰实验结果或刮伤细胞，因此需要及时排除气泡并在操作过程中注意避免其产生。

13. 纯度和鉴定：

在进行细胞划痕实验时，需要确保使用的细胞纯度高，并已经鉴定过其类型和特性。如果使用的细胞纯度低或存在混合污染，可能会对实验结果产生不利影响。

14. 细胞处理方式：

在进行细胞划痕实验时，需要考虑不同细胞处理方式的影响，如静态处理、机械处理、化学处理等。

15. 细胞处理时间：

在进行细胞划痕实验时，需要考虑细胞处理时间的长短，以避免处理时间过长或过短产生的误差和变异。通常情况下，细胞处理时间可根据实验需求和要求进行适当设置和调整。

16. 控制组的设置：

在进行细胞划痕实验时，需要合理地设计和设置对照组。例如，在比较不同处理对于细胞迁移能力的影响时，可以设置未处理的对照组或添加生理盐水作为对照组，以排除因其他因素导致的误差。

17. 实验重复次数：

在进行细胞划痕实验时，需要进行足够的实验重复次数，以提高实验结果的可靠性和精确性。通常情况下，建议至少重复3次以上，并对数据进行统计学分析。

18. 安全操作：

在进行细胞划痕实验时，需要采取适当的安全措施，以避免因误操作或实验事故导致的伤害或污染。例如，在使用细胞培养皿、细胞刮刀等器具时，需要注意安全使用方法和规范操作流程，同时还需要遵守实验室的安全操作规定和标准。