【神经疾病模型】脑卒中动物模型构建

脑卒中是指由于急性脑循环障碍所致的局限或全面性脑功能障缺损综合征，或称为急性脑血管事件。

在脑卒中的患者中，缺血性脑卒中最为常见，约占总数的88%，出血性脑卒中占9%，蛛网膜下腔出血约占3%。

因脑卒中的高致死率和致残率，近年脑卒中的病理生理机制及细胞、分子生物学的相关研究成为近年的研究热点。

下面本文将为脑卒中动物模型的建立方法进行综述。

1．线栓栓塞法:

传统线栓法:大鼠固定麻醉后，常规备皮消毒，取颈部正中切口，分离颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，分离结扎并切断ECA，结扎翼腭动脉(PPA)，夹闭CCA和ICA，将线栓由ECA残端插入，经ICA进线约18mm插入MCA入口，形成MCA栓塞模型。

在传统线栓法的基础上，经过不断改进，形成改良方案:从CCA插入线栓经ICA至MCA起始处，改良方案无需结扎PPA，局部组织损伤小，操作更为简单，成功率更高。

大脑中动脉及其分支，是脑梗塞最常累及的颅内血管，其发病率约占70%。因此，选择小鼠大脑中动脉进行栓塞，能够更好地模拟人类缺血性脑卒中。

除选用上述使用线栓作为栓子外，还有学者使用其他物质作为栓子进行栓塞。

例如:

舌下静脉注入铁粉模型、左心室注射液体石蜡模型、颈内动脉注入微小栓子等血管内注入外来栓子制备多发脑梗塞模型。

2. 开颅手术模型

开颅手术模型需切除部分颅骨，分离硬脑膜，暴露大脑中动脉进行手术。闭塞大脑中动脉的手术方式大致分为三类:

①开颅大脑中动脉阻断模型:分离腮腺、颞肌，离断颧弓，切除大脑中动脉上方的颅骨，进行永久性离断、结扎或电凝大脑中动脉、光化学栓塞、三氯化铁化学诱导中动脉栓塞、局部内皮素注射诱导栓塞等，建立缺血性脑卒中模型;

②开颅三血管阻断模型(3vo模型):在上述开颅永久性阻断一侧大脑中动脉的基础上临时阻断双侧颈总动脉，以减少侧枝循环的影响，和加强缺血性损伤。

③颅骨钻孔去皮层血管缺血手术模型:

麻醉后，剪开颅顶皮肤，暴露颅骨。在颅骨正中线左侧用牙科钻分别钻6个孔，用眼科剪沿着6个孔翻开颅骨，暴露硬脑膜;用虹膜剪剪开硬脑膜，暴露软脑膜，在解剖显微镜下用沾生理盐水的棉签轻轻擦拭软脑膜上的血管，直到镜下看不到血管为止，形成缺血性脑卒中模型。

上述模型的特点是开颅可在直视下操作，成功率较高，但需要开颅，创伤性较大，破坏血脑屏障，引起脑脊液漏，感染几率增大，成功率与手术技术相关。

3. 血栓形成法

通过形成血栓建立脑缺血模型的方法有3种：光化学法、自体血栓法和FeCl3致血栓形成法。

3.1光化学栓塞法

原理是基于血管内光氧化导致血栓形成，使荧光照射区域局灶血管内皮过氧化损伤、血栓形成及脑皮质缺血性损害。选定照射部位，充分暴露颅骨，大鼠尾静脉注射玫瑰红B，用相应光源进行照射。

部位大小可按照需要调整，一般选在皮质功能区如运动感觉区，以利于评定观察。

具体方法：是通过给动物循环系统内或小鼠腹腔内注射一种光敏染料，例如玫瑰红或赤藓红，然后使用特定波长的光束透过颅骨照射选定的区域，激活光敏染料，此过程产生的氧自由基，导致照射区域内软脑膜及脑实质血管内皮损伤，血小板活化聚集，形成光化学栓塞模型。

3.2自体血栓法

自体血凝块经颈动脉注射，制成大鼠脑栓塞模型。

具体方法是：动物自体血加凝血酶块制成血栓，导入目标动脉阻断血流，造成脑组织缺血。

该模型可产生显著而持久的供血中断，形成范围衡定和边界清楚的梗死灶，在确定血栓注射入颈内动脉后，造模成功率达80%以上。

本模型具有良好的稳定性和可重复性，更贴近临床脑栓塞特征，适合于各种脑缺血实验研究，尤其是溶栓治疗的研究。

3.3 FeCl3致血栓形成法

FeCl3致血栓法制成大脑中动脉栓塞的方法是：暴露大脑中动脉，将吸有50%FeCl3溶液10μL的小片定量滤纸敷在大脑中动脉上，30min后取下。FeCl3损伤局部大脑中动脉血管内皮，使血管内膜脱落，进而激活血小板，导致局部血栓形成，最终大脑中动脉供血区出现梗塞。

此模型出现的神经症状、脑梗死范围等指标与线栓法致大脑中动脉栓塞模型基本接近。

4.直流电刺激颈总动脉法

使用直流电刺激颈总动脉制造血栓，通过血流引导碎栓堵塞中动脉，制造脑栓塞模型。

具体方法是:将大鼠麻醉固定，纵向剪开颈部皮肤，分离颈外动脉、颈总动脉与颈外动脉，夹闭颈外动脉，剥离动脉鞘及神经，将颈总动脉放入血管电击夹沟槽内进行电击，可见电击血管内形成血栓，夹闭颈总动脉远心端，用软质镊子夹动形成血栓的血管处，使血栓与血管壁分离，开放颈总动脉处动脉夹，可见血栓随血液流动进入颈内动脉后立即夹闭颈总动脉近心端10～15min，到时间后打开全部动脉夹，形成栓塞模型。

该模型改进了以往需开颅进行电凝的手术方式，无需开颅减少了手术对脑组织的损伤，更为接近心源性栓塞的病理过程，造模成功率较高、梗死面积稳定，造模后能够表现出相应的神经与运动功能障碍。

5. 栓子栓塞阻断法

通过注入栓子建立脑缺血模型的方法主要有3种：硅胶柱/硅胶颗粒栓子栓塞阻断法、月桂酸钠法、中药提取物注入法。

① 研究发现利用硅胶柱栓子注入大脑中动脉主干可栓塞相应血管，形成可靠、重复性好的犬深部脑梗死模型。

② 研究表明经颈外动脉向颈内动脉注射硅胶颗粒，硅胶颗粒属于微栓子，随血流进入颈内动脉引起脑血管栓塞。此方法可建立基本稳定的脑栓塞动物模型，用于急性脑缺血研究。

③ 应用月桂酸钠建立兔脑局部缺血模型，其方法是将月桂酸钠溶液注入兔颈内动脉后造成局部脑缺血。

月桂酸钠导致血栓的原理是，损伤血管内皮细胞，进而引起血小板粘附聚集。应用月桂酸钠制作局部脑缺血模型能尽量减少脑手术损伤，而且可以避免颅内组织暴露于大气中，颅内环境稳定性并未遭到破坏。该方法中动物可存活较长时间，便于影像动态观察，且具有较高的成功率。

④ 有研究者采用中药白芨及其加工物作为栓塞剂建立大鼠脑缺血模型，其方法为：由颈内动脉注入一定量的白芨微粒悬液或白芨胶，栓子进入颈内动脉-大脑中动脉系统，阻塞大脑中动脉分支及动脉开口。白芨富含黏胶类物质白芨胶，白芨胶由甘露糖和葡萄糖聚合而成，无毒、无抗原，具有促进红细胞积聚、缩短凝血时间及凝血酶原时间的作用，能促进血栓形成。

研究资料表明白芨胶或白芨微粒是理想的血管栓塞剂。

6. 内皮素-1灌注致血管收缩法

为大鼠脑内埋置一根套管至大脑中动脉附近，通过套管在动物大脑中动脉附近局部微量注射内皮素-1，可建立局灶性脑缺血模型。

内皮素-1是迄今为止发现的最强的血管收缩因子之一，在体外对血管平滑肌有持久而强的收缩作用。将内皮素-1直接注入活体的脑组织能明显减少局部血流，导致局部组织损伤，因此可用于大脑中动脉周围注射诱导局灶性脑缺血。在大脑中动脉周围注射内皮素-1后，动物可出现明显的神经症状，神经元减少，以及脑水肿和梗死灶。与其他脑缺血模型相比，脑内局部注射内皮素-1可在动物清醒状态下诱导脑缺血，从而直接观察缺血后动物的行为改变，同时可避免线栓法对血管内皮的机械性损伤以及麻醉对脑缺血过程的影响。

7.球囊导管法

利用自制微球囊导管盲插法建立猕猴大脑中动脉闭塞再灌注模型。

为提高稳定性和可重复性，经颈总动脉或股动脉介入手术，将标准微球囊导管插入大脑中动脉的起始部，然后充盈微球囊以阻断大脑中动脉血流，退出微球囊后实现大脑中动脉血流再灌注。

此方法易于标准化操作，手术成功率高，重复性好，手术过程无需退出球囊即可通过微球囊导管向大脑中动脉注射微量药物，为后续治疗研究提供了有利条件，且可用于其他大型动物，应用前景好。

1. 开颅出血性脑卒中模型

建立开颅出血性脑卒中模型是通过直接行手术局部开颅、解剖定位颅骨钻孔、立体定位等技术打开颅骨，选择不同物质注入到脑内特定区域制作开颅出血性脑卒中模型。根据注入脑组织物质不同分为下面3类方法:

① 自体血注入法:抽取自体动脉(尾动脉、股动脉、心室腔等)或静脉血，开颅后向颅内注射血液(注射部位多选用尾状核进行注射)形成脑出血模型。为减少蛛网膜下腔积血和针道返流，有学者将该方法进一步改进，如低压注射法、二次注射法、三次注射法、微量泵控制注射法及自体凝固血注射法等，经上述改进，模型的稳定性、重复性均有所改善。

② 胶原酶注入法:该方法是向特定区域脑组织内注射可破坏血管壁的药物(如胶原酶、胶原酶+肝素、胶原酶+自体血等)造成局部血管壁破裂导致脑出血。

该模型的出血量取决于胶原酶的用量，所产生的出血面积、形态、部位重复性较好，但该方法诱导脑出血以渗血为主，与临床所见脑血管破裂出血有一定差距。

③ 植入惰性物质建立脑出血模:通过向脑内植入惰性物质如微气囊、石蜡油等，产生类似血肿的占位效应。该模型的优点是可人为控制气囊内的气体量，能产生一致、可重复的脑损害，避免了自体血注入法中血液进入蛛网膜下腔或破入脑室以及血肿形态不一的缺陷，并可以逐渐放气，有利于了解占位物质逐渐清除后的效应，但外来异物不能模拟出血后脑组织病理损害及细胞毒性。

2．非开颅出血性脑卒中模型

根据血管内穿刺法制备大鼠蛛网膜下腔出血模型的方法提出穿刺颈动脉制备脑出血模型的理论。

该方法通过颈外动脉刺入导丝，应用头皮导联脑电图及局部脑血流量监测进行穿刺定位，因大鼠蛛网膜下腔出血模型制备目前已成熟，运用该方法制备脑出血模型理论上有一定可行性，但该方法尚未应用实践于实验中。

选择动脉穿刺符合脑出血模型动脉出血的要求，避免穿刺过深损伤脑组织，省去各种方式的采血过程，减少了对大鼠的损害。该方法应用于实验有一定困难，因行颅外部监测进行定位准确性差，且出血量无法控制，有待进一步研究。

改变大鼠基因获得的易卒中型自发性高血压大鼠(SHRSP)和易卒中肾血管性高血压大鼠(SHRSP)随着生长时间的延长，可产生自发卒中大鼠模型。

但因SHRSP大鼠的遗传局限性、易变种、断种和饲养困难的特点在实验中的应用受到限制，而RHRSP大鼠无遗传局限性、无需特殊喂养、动物廉价易得、造模技术简单，而被广泛应用于动物实验中。

RHRSP大鼠自发卒中率可达56．4%，其中脑出血19．4%，脑梗塞41．9%，蛛网膜下腔出血3．2%，混合性中风35．5%。为进一步增加RHRSP大鼠的自发卒中率。

将RHRSP给予大鼠寒冷刺激诱发大鼠发生脑卒中，该方法诱发的脑卒中类型以脑出血为主，发病过程更符合人类高血压动脉硬化基础上脑卒中发病的自然状况，但该模型有卒中类型不能确定、造模成功率低、造模周期较长等缺点。

为改进上述不足，有学者在制备RHRSP大鼠后，联合上述各种制备缺血性或出血性脑卒中的方法，制备RHRSP缺血性或出血性卒中动物模型，以更好地模拟人类高血压动脉硬化脑卒中模型。

1. 颈动脉结扎法

单侧颈总动脉结扎法:该方法损伤小，模型成功率高，死亡率低，被广泛应用于卒中模型的建立。双侧颈总动脉结扎法:分为两类:

①四血管闭塞法(4vo模型):

方法是电凝阻断双侧椎动脉24h后夹闭双侧颈总动脉，根据颈总动脉夹闭时间(10min，20min，30min)不同，制造不同程度全脑缺血再灌注模型，多用于脑缺血再灌注神经损害的研究，但手术难度大，并发症多，造模成功率低。

②二血管阻断法(2vo模型):

方法是通过阻断双侧颈总动脉加动脉放血，造成低血压而形成全脑缺血模型，亦多用于脑缺血再灌注神经损害的研究。此方法仅适用于大鼠，不适用小鼠

2vo模型与4vo模型相比较，其动物模型存活率更高，但缺点是阻断双侧颈总动脉仅造成不完全性脑缺血，需在此基础上形成低血压方可形成全脑缺血模型。

2. 心脏骤停法

利用呼气末夹闭气管致窒息、3kg重物压迫胸部、夹闭心底血管丛3种方法致心脏骤停，引起脑血流中断。心脏骤停后造成的突然血流中断对大脑损害严重，脑组织缺血缺氧10s左右即可出现意识丧失，造成全脑缺血性损伤。

3. 颈动脉分流法

通过夹闭大鼠双侧颈总动脉，同时经右颈外动脉持续抽吸颈总动脉内血液，造成大鼠全脑缺血。该方法具有效果可靠、再灌注充分、制备简便、成功率高，并可经颈动脉注入药物等优点，适用于全脑缺血再灌注损伤及其干预措施的实验研究。

体外模型可以通过剥夺细胞的能量来源模拟脑缺血，进而研究特定的分子机制。

诱导模拟脑缺血的方法主要有两种:氧糖剥夺和阻断细胞代谢的化合物或酶。

在体外模型中，最常用的为氧糖联合剥夺，在低氧环境中，正常的O2/CO2被N2/CO2所取代，而培养基中则省略了葡萄糖。通常，细胞培养物暴露于氧糖剥夺环境中1～24h可引起广泛的神经元死亡。而模拟脑缺血再灌注损伤可通过回归正常培养条件来实现。

体外模型中主要有两种细胞模式:器官型脑切片与原代细胞培养。

所有的体外模型主要模拟全脑缺血的情况，而脑切片更好地模拟局灶性脑缺血的情况。缺血半暗带中可发现神经元逐渐去极化，体外模型中器官型脑切片可模拟这一情况。此外，大脑切片可从人类脑组织中制备出来，并进行氧糖剥夺试验。

体外建立血脑屏障模型是了解脑卒中病理生理过程的一种重要方法。

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