【5分钟讲透实验】影响TUNEL染色实验结果的因素综述

凋亡细胞的TUNEL染色已在科学研究中广泛应用。由于TUNEL染色的步骤多，操作精细，影响DNA断裂的因素多，实验结果往往不够准确致使实验失败。

总结多年实验经验，下文将从组织的取材方式、取材大小、固定剂选择、组织离体后缺血时间、组织在固定剂内的固定时间以及实验操作中的诸多细节等方面进行讲解TUNEL染色实验。

1. 取材方式

TUNEL染色实验前动物实验取材建议使用以下方式：

麻醉后心脏灌流取材：将动物麻醉后先用生理盐水从主动脉灌流，待动物体内血液冲洗干净后再用固定剂进行灌流，直到动物身体僵硬死亡。这种取材方式能最大限度地使动物组织器官及时得到固定，缺点是不能取血，无法获得血液标本。

这类取材方式可以将组织在未离体的情况下先行固定，极大地保留了组织的原始状态，能获得准确的实验结果。

2. 取材大小

取材大小直接影响固定剂穿透组织的速度。即使是动物组织也不要过大，更不能将整个脏器直接放入固定剂内。

肝脏取材只取1—2叶肝脏即可，并将其切成约5mm左右的一段或者两段，待24h后再二次取材，切成2—3mm厚度的组织块（肺脏和大脑也是一样）。

肾脏取材后要将肾脏冠状面剖开，待初步固定后再二次取材。消化道的取材要用生理盐水将内容物轻轻清洗干净再取材。其它组织如胸腺、甲状腺、气管、脑垂体等可直接放入固定液内。

3. 组织固定

（1）固定液建议使用4%的多聚甲醛进行固定，不建议选用乙醇和甲醇，也不能选用甲醛替代，因为市面上购买得到的甲醛大多含有甲醇。这会使我们后续的染色过程中标记效率降低，难以观察到荧光。

含有甲醛的固定剂及在组织透明过程中使用的二甲苯都会影响DNA的结构，破坏DNA链使之断裂。在经常使用的10%中性甲醛或4%多聚甲醛固定液中，甲醛能使DNA断裂，而造成假阳性结果。

推荐使用含有乙醇的Carnoy固定液，它穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，在有效保证组织抗原抗体稳定性的同时也能有效保证细胞核内DNA与ＲNA的结构。

（2）固定液的浓度不可过高，浓度过高的固定液会使组织边缘迅速固定，影响液体的穿透，影响固定效果，导致组织中心的细胞自溶、DNA链不规则断裂等情况的发生，实验结果出现假阳性。

（3）固定时间不可过长，太长的固定时间会影响试剂的染色效率。

组织在固定剂内时间过长与过短均可影响蛋白质和核酸的结构。甲醛可使DNA断裂，因此，组织在甲醛或多聚甲醛内的时间不宜超过72h。

Carnoy固定液虽然不含甲醛，但其所含的氯仿具有一定的挥发性，时间过长固定液的作用降低，因此，建议应控制在72h内为佳。

4. 组织离体后的缺血时间

从组织取材后到放入固定剂有一定的时间间隔。

如果间隔时间过长，组织离体缺血缺氧会发生变性甚至坏死，DNA也会断裂、溶解，从而影响实验结果。动物实验组织取材后往往需要称重等操作，会延长组织的离体缺血时间。

综上，组织离体后到放入固定剂的时间越短越好，最好的办法是组织的原位灌注固定，如果条件不允许也不要超过60min。

由于TUNEL操作步骤多，在实验操作中往往由于细节上的疏忽使实验失败。总结多年操作经验，我们认为应注意以下问题。

1. 阳性对照

实验前应选择好阳性对照切片。一般试剂公司会提供1—2张阳性对照，如果没有可以选择凋亡细胞比较多的有生发中心的淋巴结作为阳性对照。这一点非常重要，它是评价所有操作过程的准确性和可靠性的阳性标准。

2. 阴性对照

阴性对照是实验标本不加末端转移酶(TDT)进行温箱孵育，这是控制结果质量的重要参照。

3. DNA的暴露

由于DNA在细胞核内，必须经过一定的处理才能暴露出来。

目前已知暴露DNA的方法有多种，如：枸橼酸盐的微波修复、高压修复、蛋白酶k的消化等。

至于选择哪种方式，应该按照说明书的操作规程来做，因为生产商在产品出厂之前会对该产品进行测试，一般认为说明书所写暴露方法为最佳方法。

我们不能为追求高阳性率而改变操作方式，即使是按说明书上的操作程序进行，但有些条件也需要操作者在实践中摸索。例如蛋白酶k的消化时间和浓度，不同的组织以及组织的新旧都会影响其作用效果。

4. 操作中切片的干燥与湿润

目前的TUNEL试剂盒大都有两种显色方法，即可用荧光显微镜观察，也可在DAB显色后使用普通生物显微镜观察，试剂盒往往注明这两种方法都能得到很好的结果。

如果使用荧光显微镜观察，在滴加TUNEL反应液(TDT液)和标记辣根过氧化物酶(HＲP)的荧光素抗体前，必须保持切片干燥，这样能使荧光素牢固地与TDT结合，荧光强度最佳。

如果使用普通的生物显微镜观察则恰好相反，实验中必须保持切片的湿润，如果在滴加TUNEL反应液(TDT液)和标记HＲP的荧光素抗体前切片干燥，会产生严重的背景色，影响观察。因此，实验者应根据需求采用最佳方法。

5. 反应液

适当延长 TUNEL 反应液的时间，一般是37ºC 1 h，也可以根据细胞凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至 2 h，但要结合你最终的背景着色。

6. 显色时间

应严格观察阳性对照和阴性对照组细胞核的显色时间，一旦阳性对照组细胞核显现出棕黄色应立即停止，如果阴性对照组有背景显色，则提示显色过度，可能出现假阳性结果。

高质量的阳性结果是高倍镜下细胞核被染成棕黄色，而细胞的其他成分不显色。至于是否对切片进行套染，这并不重要，如需套染则主张应用甲基绿或苏木素。

7. 脱蜡水化

Tunel检测需充分脱蜡水化，脱蜡可以先 60ºC 20 min，再使用二甲苯两次 5-10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀。

8. 孵育

一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用 10-30 min，几 μm 切片用短时间；几十 μm 切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。实验结果出现的假阳性也可能与Tunel染色孵育步骤有关，Tunel染色液孵育时间过长，可能会出现非特异性荧光。

提倡用37℃的温箱进行孵育，孵育过程中要使用盖玻片、塑料薄膜等覆盖，防止孵育液的挥发。

9. 操作细节

① 避光操作：荧光在普通光照下不能长时间保持荧光，所以，在进行需要避光操作的步骤时，我们要严格进行避光操作，避免荧光淬灭导致不能对实验结果有准确判断。

② 轻柔操作：贴壁细胞在加药诱导凋亡后，细胞状态会发生改变，细胞形态皱缩边缘，其贴壁粘附力降低。在对此细胞进行实验染色时，需要小心操作，避免吹打造成的细胞脱落，尤其是我们在对细胞的多次洗涤时操作更要小心轻柔。

③ 曝光：在进行荧光显微镜观察时，根据显微镜的不同，具体参数曝光时间建议在1000ms以内，增益参数建议在500%以内，或不开增益曝光时间控制在2000ms以内，过度曝光也会增加实验的假阳性。

10. 阳性结果的判断

这是实验的最后一步，也是最关键的一步。

在TUNEL染色中凋亡细胞核为棕黄色，单个细胞或散在存在，多存在于坏死与正常组织的交界处，在坏死的组织中凋亡细胞反而少见。背景为无色或复染后的绿色或蓝紫色。

问题一、荧光信号弱或没有荧光信号

问题二、非特异性染色（假阳性高）

问题三、荧光背景强