免疫/抗血管药筛选

类器官模型在免疫治疗和抗血管生成药物筛选中展现出独特优势，能够模拟肿瘤的三维结构、异质性及部分微环境特征，为药物发现提供更接近生理状态的平台。‌‌

‌类器官模型构建与免疫/抗血管特性模拟：‌
类器官可从患者肿瘤组织直接培养（ASC来源）或多能干细胞分化（PSC来源），保留原始肿瘤的基因突变、分子特征和空间组织结构。‌‌在免疫药物筛选中，通过共培养技术引入免疫细胞（如T细胞、NK细胞），类器官可模拟免疫检查点抑制剂（如PD-1/PD-L1抑制剂）或CART疗法的反应，评估肿瘤相关抗原表达及免疫逃逸机制。‌‌对于抗血管药物，类器官可通过添加内皮细胞或调控VEGF信号通路相关因子（如FGF、EGF），模拟血管生成微环境，筛选靶向血管内皮生长因子受体（VEGFR）的化合物。‌‌优化培养条件（如调整基质胶成分、生长因子浓度）可提高类器官对药物的敏感性，例如在结直肠癌类器官中去除Wnt3a和R-spondin1可增强化疗药物反应。‌‌

类器官培养、免疫细胞共培养及抗血管药物筛选的关键步骤，适用于肿瘤微环境模拟及药物敏感性评估。操作需在无菌环境中进行，建议使用预包被培养皿（如Matrigel）以促进类器官形成。

一、类器官构建与免疫共培养

1、类器官诱导与分化‌

使用多能干细胞（如hESC或hiPSC）在无饲养层条件下培养，培养基含血清替代品和生长因子（如VEGF-A、FGF2）以支持血管生成。
第3天添加中胚层诱导剂（如Forskolin），第5天将聚集体嵌入胶原-基质胶混合凝胶，转移到低附着培养皿中，形成血管网络结构。
传代时，用预冷缓冲液（如PBS）轻柔洗涤类器官，避免机械损伤，通过离心分离基质胶层。

2、免疫细胞共培养‌

采用Transwell上下室分隔法或基质胶共同包埋法，将外周血单核细胞（PBMC）与类器官共培养，模拟肿瘤免疫微环境。
PBMC制备：通过梯度密度离心分离外周血，去除血浆层后，用PBS洗涤白膜层细胞，确保淋巴细胞纯度。
共培养中，定期添加细胞因子（如IL-2）以维持免疫细胞活性，避免过度刺激导致类器官退化。

二、抗血管生成药物筛选

1、药物处理与培养‌

将类器官-免疫共培养物接种于96孔板，每孔约300个类器官片段，确保均匀分布。
添加不同浓度的抗血管药物（如VEGFR抑制剂），培养5天，期间每2-3天更换新鲜培养基，防止药物降解。
设置阴性对照（无药物）和阳性对照（已知有效药物），以评估药物特异性。

2、结果评估‌：

形态学分析‌：通过显微镜观察类器官血管网络变化（如分支减少或管腔闭合），评估药物对血管生成的抑制效果。
功能检测‌：使用高内涵成像（HCI）监测细胞凋亡标志物（如Caspase-3活性）和免疫细胞浸润程度，量化药物杀伤效率。
数据记录：结合图像分析软件（如ImageJ）生成IC50值，反映药物敏感性。

三、注意事项与优化建议：
质量控制‌：定期检测类器官支原体污染，确保培养体系无菌；免疫细胞活性需通过流式细胞术验证。
技术优化‌：对于紧实类器官（如结肠类器官），优先使用TrypLE酶解离，避免长时间消化导致细胞损伤。
应用扩展‌：本方法可适配高通量筛选（HTS），通过自动化液体处理系统提升通量，适用于个性化治疗研究。