心脏类器官

心脏是哺乳动物最先形成的器官之一，这使得它极易受到内在和外在疾病因素的影响。

心肌细胞的分化受转录途径的调节，产生不同的心肌细胞群，例如窦房结细胞、房室细胞、心房细胞、心室细胞和浦肯野细胞。

每个群都与特定的心脏疾病相关，因此可以通过类器官对相关疾病进行建模。3D 培养心脏类器官（human cardiac organoids，hCOs）由于具有更复杂的结构和更多样的细胞类型，正在逐步成为更适用于研究心脏发育、物测试的体外模型。

人多能干细胞的培养方法

 一、实验准备

1、人多能干细胞培养基配制

（1）2-8℃解冻 hPSC Medium Supplement，融化后上下晃动混匀，按实际用量进行分装，立即使用或储存于-20 - 80℃，避免反复冻融；

（2）按 1:50 的比例将 hPSC Medium Supplement（10mL）加入到 hPSC Medium Basal Medium(500mL)中，混合均匀即成为人多能干细胞培养基（abs9403）。

注意：混匀后的人多能干细胞培养基可在 2-8℃ 稳定储存 2-3 周，不建议使用配制已超过 3 周的人多能干细胞培养基。

（3） 实验试剂平衡：人多能干细胞培养基实验前放置室温避光平衡；PBS，消化液等 37℃加热。

注意：培养基中含有因子，不要 37℃水浴加热。

二、操作方法(以下步骤皆应在无菌条件下操作)

hPSC 细胞复苏：

1、实验操作步骤：

1.1、基质胶包被培养板：取出 6 孔板/12 孔板，每孔内加入 1 mL/0.5 mL 即用型基质胶（abs9410），轻轻晃动 6 孔板/12 孔板使基质胶完全覆盖皿底，置于 37℃培养箱中孵育 1h~2h，实验前拿出并置于超净工作台/生物安全柜中室温下平衡 20min。如果暂时不用，可用 Parafilm 封口后 2-8℃ 储存，并于 1 周内使用。

注意： 

①一支冻存的干细胞的数量在 1×10 6cells/mL 左右，对应 6 孔板 1 孔；

②即用型基质胶对温度敏感，即用即拿，用完后立即放回 4℃冰箱保存，且勿用手直接触碰基质胶液面所及的瓶身，影响基质胶质量。

1.2、先将 2~3mL 的干细胞培养基加入 15mL 离心管中备用。

1.3、解冻：将从液氮中取出的冻存管快速浸入 37℃温水中，快速摇动，使其在 1~2min 内快速解冻；

注意：细胞从液氮中拿出的速度要快，尽量减少其暴露在室温中的时间。

1.4、离心：冻存管中的冻存液解冻后，将其逐滴加入含有干细胞培养基的 15mL 离心管中，将 15mL 离心管置于低速离心机中配比平衡后，1000rpm 离心 3min；

1.5、重悬：离心后弃上清加 1mL 人多能干细胞培养基对干细胞沉淀进行吹吸混匀，吹吸 3~5 次左右。

1.6、接种：吹吸均匀后，将已经平衡好的即用型基质胶弃掉，将吹打均匀的干细胞悬液加入到已经包被好的 6 孔 板中，并补全每孔 2mL 培养体系。

1.7、培养：接种后的 6 孔板可以置于倒置相差显微镜下观察接种的干细胞密度以及细胞团块大小，呈 4 个细胞以上的团块较合格，水平十字轻轻晃动 6 孔板/12 孔板使细胞均匀分布。并置于 37℃，5%CO2的恒温培养箱培养， 第 2 天观察细胞贴壁情况；

1.8、换液：从复苏的时间开始每 24h 换液一次。

注意：因培养基中活性成分只足够维持一天，所以每 24h 应及时更换新鲜培养基。

多能干细胞（PSCs）集落

hPSC 细胞传代：

2、实验具体操作步骤：

2.1、清洗：吸掉原有培养基，贴壁缓慢加入 1 mL PBS 缓冲液并轻轻晃动，然后沿培养皿边缘吸去 PBS 缓冲液；

2.2、消化：在 6 孔板中加入 2mL/孔人多能干细胞消化液（abs9409）使之覆盖皿底，并置于 37℃培养箱中 2~5 min；

注意：消化时间依据干细胞生长密度，消化时间略有不同，根据经验一般建议时间 2-5min。消化过程中可以拿到倒置显微镜下观察细胞消化情况，若在显微镜下观察到大部分克隆边缘以及克隆内部细胞间出现间隙，即可吸掉消化液终止消化。

2.3、吹打：吸掉消化液后，加入 2mL 人多能干细胞培养基，用移液枪扇形吹打培养皿底，轻柔吹打 3~5 次，使皿底干细胞集落脱落，并将其并转移到 15mL 离心管中；

注意：吹吸皿底细胞的力度要轻柔，吹打脱落和吹吸混匀的次数在 3~5 次为宜，尽量避免形成单细胞。如有少量细胞无法从皿底脱落，属于正常现象。如有大量细胞无法从皿底脱落，需延长消化时间。

2.4、离心：1000rpm 离心 3min，弃上清；

2.5、接种：用干细胞培养基吹打细胞 5-10 次，吸掉包被培养板中的基质胶，并将细胞悬液加入到培养板中，且补全每孔 2mL 的培养体系。

注意：吹打细胞要温柔，并且吹打次数不要超过 10 次。

2.6、换液：从传代的时间开始每 24h 换液一次。

注意：因培养基中活性成分只足够维持一天，所以每 24h 应及时更换新鲜培养基。

多能干细胞（PSCs）集落染色图

hPSC 细胞冻存

3、实验具体操作步骤：

3.1、清洗：同 2.1；

3.2、消化：同 2.2；

3.3、吹打：同 2.3；

3.4、离心：同 2.4；

3.5、重悬：离心后弃上清，加入 2 mL ES/iPS 细胞冻存液（abs9412）对干细胞沉淀进行吹吸混匀，吹吸 3~5 次后，将其加入到冻存管中；

注意：冻存液即用即拿，及时放回 4℃冰箱。

3.6、记录：在冻存管上标记冻存细胞种类、时间、操作者及细胞批次。

3.7、-80℃冰箱冻存：冻存管置于-80℃冰箱过夜。

注意：冻存管放置于-80℃冰箱时，要将冻存管直立放置，切忌冻存管斜放或横放。

3.8、液氮冻存：24 小时后将-80℃冰箱中的细胞转移至液氮中长期冻存。

多能干诱导心脏类器官

一、实验准备

hPSC诱导分化心脏类器官试剂盒

二、诱导流程图

D0-D3：hiPSC形成EB（拟胚体）

D3-D5：EB开始扩大

D5-D7：特化EB诱导

D7：EB分化为心脏类器官

D12：出现早期搏动

D20：心脏类器官成熟

三、实验方法

1、Ⅰ阶段（D0-2）（按1个96孔板，每孔100uL算）

（1）hPSC于基质胶包被的六孔板的一个孔生长至70-80%汇合度。

（2）吸去培养基。

（3）孔中加入1mLPBS（无钙镁离子）洗，吸去。

（4）孔中加入1mLAccutase，37℃消化3min。

（5）消化完成后于显微镜下可看到克隆发白发亮。轻拍孔板侧边几下，使细胞脱离板底，加入1mL人多能干细胞培养基Plus终止消化，并使用P-1000吸头将这2mL细胞单悬液收集到15mL 离心管中，室温下300g离心5min。

（6）离心结束，去除上清至剩20ul，轻弹管底3-4下，将1mL预热的人多能干细胞培养基Plus（含10μMY-27632）重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

（7）使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞 ，按每孔5000个细胞的比例将所需细胞收集到离心管中，将基础培养基1与补充剂A充分混合，将上面1mL细胞悬液加入9mL的含补充剂A的基础培养基1中，将细胞吹打均匀，然后按每孔100uL的体积将细胞悬液接种到超低96孔板中，1000rpm离心5min，然后将孔板转移到37℃、5% CO2 细胞培养箱中孵育3天。使用低吸附96孔板，可诱导2板192个心脏类器官，成功率70-80%。

2、Ⅱ阶段（D3-4）

第3天，将基础培养基2与补充剂B充分混匀，配置成Ⅱ阶段培养基，从孔中抽吸培养基，按每孔100uL的体积将Ⅱ阶段培养基加入孔中，将培养板放入37℃5%CO2培养箱中培养，连续培养2天。

3、Ⅲ阶段（D5-6）

第5天，将基础培养基3与补充剂C充分混匀，配置成Ⅲ阶段培养基，从孔中抽吸培养基，按每孔100uL的体积将Ⅲ阶段培养基加入孔中，将培养板放入37℃5%CO2培养箱中培养，连续培养2天。

4、Ⅳ阶段（D7-21）

（1）第7天，从孔中抽吸培养基，按每孔100uL的体积将基础培养基4加入孔中，将培养板放入37℃5%CO2培养箱中培养，开始长期培养，每2天换一次培养基。

（2）心脏类器官将在分化后的10-13天开始跳动，进一步培养后第19-21天取样鉴定。