细胞3D模型构建

使用肿瘤细胞系或原代肿瘤细胞，构建一个以肿瘤细胞为核心的均质球体模型。

实验说明：

1. 模型局限性：仅模拟肿瘤细胞团块，无法反映肿瘤微环境的复杂性，可能错误评估药物效果。
2. 技术假象风险：球体中心可能因营养/氧气渗透不足而出现坏死，干扰药效评估。
3. 批间差异性：原代细胞构建的模型，其大小、密度和生长速度可能存在批次差异。

以小肠组织为例
实验材料
1、 仪器设备
CO2 培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅、水浴摇床，医用冰箱、-80°冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科镊。

2、 试剂耗材
肠癌类器官培养试剂盒，基质胶，60mm细胞培养皿，100μm滤筛，15ml离心管，1.5ml EP管若干，4度冰盒，眼科剪刀，眼科镊。

实验方法
1、原代
（1）将组织放入含有特殊组织保存液F的组织取样瓶中放入冰盒4℃，拍照并登记信息。
（2）取样瓶消毒，组织放入培养皿，结直肠癌类器官缓冲液A清洗三次后于培养皿中剪碎，大约1mm3的组织块。
（3）癌组织用organo原代酶解液C消化，37℃震荡消化10-20 min，（消化过程中随时观察消化情况）加入三倍体积organo原代酶终止液E终止消化。
（4）使用100μm孔径的筛网进行过滤，取少量滤液在镜下进行观察，可以看到明显的组织块，将滤液收集后于300g富集离心3-5min后移去上清，重新重悬离心。
（5）去除上清，使用适量基质胶（abs9495）进行重悬(24孔板为例，每孔30ul）之后进行铺板（4℃下操作）拍照追踪定位。
（6）将铺好的板子放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加培养基B（恢复室温）进行培养。

2、类器官传代培养
（1）移液器吸去培养基，添加4℃类器官缓冲液A放置一分钟。
（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置5min。（3）离心5min弃去液体，添加适量类器官缓冲液A重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体或（添加适量消化液D作用90-120S终止，离心5min弃去混合液）。
（4）类器官收集后，添加适量类器官冻存液G，按500个/ml密度冻存（或进行步骤5）。
（5）类器官收集后，基质胶重悬，每孔30μl基质胶铺在24孔板中，放置培养箱中10min添加500μl结直肠癌类器官培养基B。

3、冻存
（1）在传代第二步，添加冻存液
（2）500个/ml 密度冻存，温度梯度降温-80度，保存

4、类器官复苏
（1）取10ml于15ml离心管中。
（2）从液氮罐中取出冻存的肿瘤类器官细胞，快速置于 37℃水浴锅中融解。
（3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2 分钟内完全融解。
（4）将溶解后的类器官细胞快速转移至15ml 无菌离心管，使用移液管轻轻吹打3次，300g 离心 3分钟，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量结直肠癌类器官缓冲液A重悬移入1.5ml离心管300g离心5min。
（5）基质胶重悬，每孔20μl基质胶铺在24控板中，放置培养箱中10min添加500μl结直肠癌类器官培养基B。

5、鉴定
类器官的鉴定主要有形态学观察、基因分析、标志物检测、组织学染色这几种手段。

6、药敏
（1）药物准备阶段（药物种类、浓度）。
（2）在传代基础上接种到96孔板上，加药，牌照。在药物活性第5天检测细胞活性。