NF-KB p65活性检测实验

时间:2021-09-23浏览次数:450




【晶莱生物】核转录因子NF-kappaB(NF-kB)是一种重要的转录因子,参与调控多种与炎症、抗凋亡、肿瘤形成和转化有关的基因表达。

NF-kappaB(NF-kB)最初被鉴定为在B细胞中和免疫球蛋白k轻链的增强子结合。但随后在非B-细胞的细胞质中被发现,形成NF-kB和IkB的复合物。最初在DNA结合蛋白复合物中分离的NF-kB是由p65(RelA)和p50构成的异源双聚体。其他分离的单体包括p49(也可称为p52),p75(c-Rel),p68(RelB)。p65,p68,p75单体起反式激活作用。p50,p49(p52)单体具有DNA结合活力,但只具有微量的反式激活作用。据报道p49和NF-kB的单体p65形成具有转录活力的异源双体,类似于p50/ p65异源双体。p49/ p65和p50/ p65异源双体在细胞质中受一种叫IkBa/MAD-3的抑制剂调节。

IkB和p65单体结合,阻制了细胞核中的定位和DNA的结合。在体外高浓度的p65能形成同源双聚体,能和DNA微弱地结合。Poly(dI:dC)能抑制这一反应(14)。p49和p50也能形成同源双聚体,但在细胞中的浓度很低。通常,在作NF-kB的凝胶迁移实验时,在20ul的反应体积中,有溶于10 mM HEPES的0.28pmoles 的NF-kB9寡核苷酸(pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油, 0.05%NP-40。当用纯化的蛋白时,250-300ng足以形成凝胶迁移复合物,而需用10ug的HeLa细胞核抽提物。凝胶迁移复合物在室温中保温30分钟,在50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸的7%聚丙.烯.酰胺凝胶电泳中分离凝胶迁移复合物。含考马斯兰和二甲苯蓝色素的加样溶液只能加入到阴性对照反应中,因这两种色素会加剧NF-kB复合物的解离。当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白来源时,可形成两种序列特异的凝胶迁移复合物,即p50/p50同源双聚体和p50/ p65异源双聚体。在表达p49,p50,p65的细胞中,可检测到4个序列特异的凝胶迁移复合物(p49/ p49,p50/ p50,p50/ p65,p49/ p65),如果存在高浓度的p65,可检测到微量的p65/p65。

下列试剂可加强NF-kB在体外的结合:mM的GTP,ATP,精胺,亚精胺,钡或钙离子,ng的Co+3(NH3)6(12)。
提取组织或细胞核蛋白,利用不同形式的NF-Κb p65抗体捕获细胞核蛋白并加以区分,通过酶标仪450nm处测定核蛋白标准品与NF-Κb p65吸光度值,进行定量比较,从而明确目的蛋白的活化度。

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