CircRNA RT-qPCR检测

时间:2021-09-28浏览次数:202

定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR)是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中,总RNA或信使RNA(mRNA)首先通过逆转录酶转录成互补DNA(cDNA)。随后,以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中,其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。

RT-qPCR的一步法与两步法

RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成(图1、表1)。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起,使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中,逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成,使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。


图 1.一步法与两步法RT-qPCR


表 1.一步法及两步法RT-qPCR优缺点比较

RT-qPCR逆转录过程

总RNA与mRNA的选择

在设计RT-qPCR实验过程中,决定是否要使用总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。尽管mRNA可能能够提供略高的灵敏度,但总RNA仍经常使用。其原因是总RNA作为起始材料具有较mRNA更重要的优势。首先,其过程需要较少的纯化步骤,这确保了更好的定量回收模板和更好的把结果标准化为起始的细胞数。其次,其避免了mRNA富集步骤,这能够避免由于不同mRNA的回收率不同而带来的结果偏移的可能性。总的来说,由于在大多数的应用中,目标基因的相对定量比检测的绝对灵敏度更为重要,因此在大多数情况下,总RNA更适用1

逆转录引物

在两步法中,有三种不同的方法可用于引发cDNA反应:oligo(dT) 引物、随机引物、或序列特异性引物(图2,表2)。通常情况下,是将 oligo(dT) 引物和随机引物进行混合使用。这些引物退火至模板 mRNA 链,并提供给逆转录酶一个用于合成的起点位置。


图 2.两步法 RT-qPCR 中四种逆转录引发方法。


表 2.RT-qPCR 的 cDNA 合成中的引物注意事项。结合使用随机引物与锚定 oligo(dT) 引物可提高逆转录效率及 qPCR 的灵敏度。


逆转录酶

逆转录酶是利用 RNA 合成 DNA 的一种酶。一部分逆转录酶具有 RNA 酶活性,能够在转录后降解 RNA-DNA 杂交链中的 RNA 链。如果其不具有 Rnase 酶活性,可加入 RNaseH 以获得更高的 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶。对于 RT-qPCR 来说,理想的情况下是选择具有较高热稳定性的逆转录酶,这样 cDNA 的合成能够在较高的温度下进行,确保成功转录具有较高二级结构的 RNA,同时保持其在整个反应过程中的全部活性,从而得到更高的 cDNA 产量。

逆转录酶的 RNase H 活性

RNase H 能够从 RNA-DNA 双链中降解 RNA 链,从而允许双链 DNA 的有效合成。然而,当使用长 mRNA 作为模板,RNA 可能被过早的降解,从而导致截短的 cDNA。因此,在 cDNA 克隆过程中,如果需要合成长的转录物时,尽量减小 RNase H 的活性通常是有益的。与此相反,拥有 RNase H 活性的逆转录酶通常有利于 qPCR 的应用,因为它们能够在 PCR 的第一个循环中提高 RNA-DNA 双链的熔解(图3)。


图 3.逆转录酶中 RNase H 活性。在 qPCR 中,使用具有 RNA 酶活性的逆转录酶。


RT-qPCR 的 qPCR 过程

引物设计

用于 RT-qPCR 中 qPCR 步骤的 PCR 引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接,其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界(图4)。由于含内含子的基因组 DNA 序列不会被扩增,因此这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性的风险。

如果引物不能被设计成能够分离外显子或外显子-外显子边界,则有必要利用无 RNA 酶的 DNA 酶I或 dsDNA 酶处理 RNA 样品以除去基因组 DNA 污染。

RT-qPCR 对照

一个逆转录阴性对照(-RT对照)应该包括在所有的 RT-qPCR 的实验中,以检测 DNA 污染(如基因组 DNA 或来自之前反应的 PCR 产物)。这一对照包含除逆转录酶之外的所有反应组分。由于该对照不会发生逆转录,因此如果观察到 PCR 扩增,则极有可能来自 DNA 的污染。


图 4.RT-qPCR 中 qPCR 步骤的引物设计。1)如果一个引物被设计为跨越外显子-内含子边界,则可能造成污染的基因组 DNA 将不会被扩增,其原因是引物不能退火至该基因组 DNA 模板。相反,cDNA 不含任何内含子,能够有效被引物识别并扩增。2)当引物侧接一个长的内含子(例如1 kb),扩增反应将不会发生,因为短的延伸时间仅够用于扩增短的 cDNA,却不足以扩增基因组靶基因。

参考文献

  1. Bustin S. (ed) (2004) A-Z of Quantitative PCR.IUL Biotechnology Series, International University Line, La Jolla, California.

晶莱生物服务流程


晶莱生物实验服务项目

动物实验细胞生物学病理实验
消化系统模型细胞培养病理染色
胃酸分泌模型普通细胞株HE染色
脓毒症模型细胞缺氧培养油红O染色
胃溃疡模型细胞培养+支架番红固绿染色
胰腺炎模型干细胞培养Masson染色
肝纤维化模型原代细胞分离/提取/培养天狼猩红染色
DIO肥胖模型细胞转染/病毒感染PAS糖原染色
胆结石模型Trans well共培养阿利新蓝染色
结肠炎(UC)模型细胞增殖甲苯胺蓝染色
脂肪肝模型细胞计数尼氏染色
急性肝损伤模型生长曲线测定LFB髓鞘染色
免疫、代谢系统疾病模型存活曲线测定普鲁士蓝染色
骨质疏松模型ccK-8增殖检测VG染色
糖尿病模型MTT增殖检测EVG染色
高尿酸血症模型CFSE检测增殖-流式检测VonKossa染色
呼吸系统模型BrDU检测-免疫荧光法刚果红染色
肺纤维化模型细胞凋亡苏丹黑B染色
慢性肺阻塞模型Annexin V/PI流式检测细胞凋亡Trap染色
急性肺损伤模型WB检测凋亡相关蛋白抗酸染色
哮喘模型透射电镜观察凋亡小体革兰氏染色
肺栓塞模型Tunel染色(POD法,DAB显色)AB-PAS染色
支气管炎模型Tunel(荧光法,含试剂盒)亚甲基蓝染色
泌尿生殖系统模型DNA ladder法苯胺蓝染色
慢性肾衰模型细胞周期荧光 DAPI染色
急性肾衰模型细胞显微计数普鲁士蓝染色
肾间质纤维化模型PI染色间苯二酚碱性品红染色
肾结石模型BrdU渗入法银染
肾炎模型免疫荧光染色黑色素染色
子宫内膜异位症模型PI流式检测细胞周期镀银染色
心血管系统模型细胞运动PASM 六胺银染色
冠心病模型Transwell检测细胞迁移VG染色
心肌梗死模型Transwell检测细胞侵袭富尔根染色
心脏骤停模型细胞划痕亚甲基蓝染色
慢性心力衰竭模型细胞克隆碘-碘化钾染色
动脉粥样硬化模型集落形成法/稀释铺板方法Goldner三色法染色
白血病模型软琼脂克隆法PAS-萘酚磺S染色
高血压模型毛细管克隆法改良苯酚品红染色
神经系统模型体外实验血管生成网状纤维染色
脑卒中模型磁珠分选细胞β-半乳糖苷酶染色
栓塞性脑梗死模型流式分选细胞镀银染色
脑出血模型开机费movat五色染色
脑损伤模型单色维多利亚蓝染色
脊髓损伤模型双色免疫组化
帕金森模型CBA多细胞因子流式检测免疫组化预式
老年痴呆模型组织/血液细胞制备免疫组化正式
应激模型组织单细胞制备免疫荧光(石蜡-单标)
骨骼疾病模型中性粒细胞提取免疫荧光(石蜡-双标)
骨折模型其他样本细胞制备(如血液等)免疫荧光(石蜡-三标)
骨缺损模型外周血PBMC分离免疫荧光(冰冻-单标)
风湿免疫性关节炎模型线粒体组学免疫荧光(冰冻-双标)
骨关节炎模型线粒体膜电位检测-流式法制片前处理
五官疾病模型线粒体膜电位检测-免疫荧光法石蜡组织包埋
眼科疾病模型线粒体ROS生物含量检测--流式特殊包埋(细胞、材料、眼球等)
鼻腔疾病模型线粒体ROS生物含量检测--免疫荧光软化(肝硬化、皮肤结痂、植物等)
皮肤疾病模型线粒体通透性转换孔(mPTP)骨组织脱钙(小)
皮肤损伤模型溶酶体免疫荧光法骨组织脱钙(大)
肿瘤疾病模型线粒体+溶酶体共定位骨组织EDTA脱钙(小)
原位瘤模型内质网骨组织EDTA脱钙(大)
转移瘤模型线粒体钙瞬时变化检测-流式石蜡白片
皮下植瘤模型ATP检测细胞爬片

ADP检测

AMP检测



流式DNA/RNA半定量检测基因编辑工具
组织细胞悬液处理pcr检测mRNA合成(3保1)片段/质粒/引物合成
细胞处理microRNA检测质粒载体构建
血液标本处理LncRNA表达量的检测过表达腺病毒载体构建包装
细胞刺激培养CirRNA表达量的检测shRNA腺病毒载体构建包装
单色检测凝胶电泳过表达慢病毒载体构建包装
双色检测基因合成shRNA慢病毒载体构建包装
Annexin V/PI凋亡<300过表达腺相关病毒载体构建包装
细胞周期300-1,500shRNA腺病毒载体构建包装

1500 - 5000稳转细胞株

>5000

特殊序列



ELISAWBqPCR
组织匀浆处理蛋白提取及定量一RNA抽提
ELISA(不含试剂盒)48T/kitWB检测一(10孔膜/指标)mRNA引物设计及合成
ELISA(不含试剂盒)96T/kit灰度值分析及作图一(10孔膜/指标)miRNA引物设计及合成
ELISA(含国产试剂盒)48T/kit蛋白提取及定量二LncRNA引物设计及合成
ELISA(含国产试剂盒)96T/kitWB检测二(10孔膜/指标)CircRNA引物设计及合成

灰度值分析及作图二(10孔膜/指标)mRNA RT-qPCR


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LncRNA RT-qPCR


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