干细胞培养

干细胞（Stem cell）即起源细胞。在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度化分而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞。因此，干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。

• 能自我更新和分化

• 具自我复制的能力

• 能在一定条件下分化成具有特定形态和功能的成熟细胞

2、胚胎干细胞

• 从囊胚期胚胎的内细胞团获得

• 胚胎生殖细胞与胚胎干细胞都可自发分化形成三胚层的全部细胞

3、成体干细胞

• 特定的组织中

• 能自我更新并分化成相应组织内具有特定功能的成熟细胞

• 可塑性

一、培养条件

1. 环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统， 能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。

2. 设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。

3. 实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。

4. 试剤：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剤。

试剤的配制：

① DMEM培养基：去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3

② MEF培养基:DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml青莓素,1000g/ml链霉素

③ ES培养基:ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS, 1000u/ml青莓素，1000g/ml链霉素，1mM丙桐酸钠，0.1mM非必须氨基酸，2mM谷氨酰胺，0.1mM筑基乙醇，1000u/ml白血病抑制因子

④ D-Hank's： 0.8%NaCI，0.04%KCI， 0.035%NaHC03， 0.006%KH2P04，0.005325%Na2HP04, 0.001% 酚红

⑤ 0.1%明胶:D-HanK's溶液中含0.1%的明胶

⑥ ES细胞冻存酒:90% ES培养基，10% DMSO

⑦ MEF细胞冻存酒：90% MEF培养基，10% DMSO

⑧ Feeder 细胞冻存酒：90% FBS , 10% DMSO

⑨ 丝裂莓素C：根据产品说明书来配制

二、培养步骤
常见的干细胞培养是胜胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。

1. 小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts, MEF）的复苏

胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。

① 在37P水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。

② 把融化的细胞悬浮酒加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后,1000xg , 5min离心收集细胞。

③ 吸掉上清（除去冻存酒中的DMSO）,用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细 胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。

④ 根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长滴整个培养皿，这时可以进行传代、冻存 或用于制备滋养细胞层。

2. 滋养细胞层（feeder cells layer）的制备

① 把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入 110μL配好的丝裂莓素C,混匀后放入培养箱培养2h。

② 把含有丝裂莓素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使 用该培养基处理细胞5hh。用PBS（不含二价离子）洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消 化细胞，37°C培养箱放置约3min,直到细胞悬浮起来。

③ 用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000xg离心5min。

④ 去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1 %明胶处理过的细胞培养皿 中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37°C培养箱中至少 放10min,之后把明胶吸掉即可）

⑤ 一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可 用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把 细胞冻存。

3. 小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells, ES cells）的复苏

① 在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。

② 把融化的细胞悬浮酒加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中,轻轻混匀后,1000xg , 5min 离心收集细胞。

③ 吸掉上清（除去冻存酒中的DMSO,用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋 养细胞层的细胞培养皿中，放入37°C,含有5%CO2的加湿培养箱中培养。

④ 根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长滴整个培养皿，这时可以进行传代、冻 存或用于后续试验。

4. 小鼠胚胎干细胞的传代

① 吸掉培养基，用PBS（不含二价离子）洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放 置约5min，直到细胞基本悬浮起来。

② 用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000xg离心5min。

③ 去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有 滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1：1到1：10。

5. 小鼠胚胎干细胞的冻存

① 吸掉培养基，用PBS（不含二价离子）洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37°C培养箱放 置约5min,直到细胞基本悬浮起来。

② 用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000xg离心5min。

③ 去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般 一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管）,按每管1 ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4°C20min, -20°C20min, -80°C过夜后迅速转入液氮中。

三、注意事项
1. 丝裂莓素C在操作时要避光，避免其分解。
2. ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
3. ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
4. 为避免水或血清帯来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。


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