五分钟文献解读之《SSRP1促进结直肠癌进展,并受到miR-28-5p的负调控》
时间:2021-12-27 阅读:1531SSRP1promotescolorectalcancerprogressionandis negativelyregulatedbymiR‐28‐5p
(SSRP1促进结直肠癌进展,并受到miR-28-5p的负调控)
期刊:J Cell Mol Med 影响因子:5.310 发表日期:2019年 研究背景 结直肠癌(CRC)是最常见的诊断癌症之一,也是全世界癌症死亡的主要原因之一。结直肠癌通常在晚期诊断,伴有转移,与患者生存率呈负相关,并且结直肠癌仍然无法治愈。因此,迫切需要发现新的诊断和预后标志物,更好地理解结直肠肿瘤发生和转移的分子机制。 结构特异性识别蛋白1(SSRP1)是组蛋白伴侣促进染色质转录(FACT)复合物的亚单位,参与几乎所有染色质相关过程,包括DNA复制、修复和转录,在维持未分化细胞状态中起主要作用。此外,SSRP1在各种肿瘤中表达上调,如乳腺癌和卵巢癌,并且与较差的预后相关。 SSRP1的一种抑制剂CBL013通过阻断SSRP1依赖性p53激活以及下调一部分核因子-κB(NF-κB)依赖性基因导致细胞凋亡。这些结果表明SSRP1是癌症治疗的潜在靶点。然而,SSRP1在大肠癌中的作用、机制和临床价值尚不清楚。 技术路线 研究内容 一、检测结直肠癌(CRC)组织和相应正常组织中SSRP1的表达水平 (1)微阵列数据分析 我们首先分析了来自两个独立数据集GSE32323和GSE4107的结直肠癌患者中SSRP1mRNA的表达。这两个数据集包括成对的大肠癌肿瘤和相邻的非癌组织的mRNA信息。如图1A所示,人类结直肠肿瘤组织中的SSRP1mRNA水平显著高于相邻正常结直肠组织中的水平。 (2)qRT-PCR实验 为了验证微阵列分析结果,我们对人结直肠腺癌标本及其配对正常组织进行了qRT-PCR实验。与各自匹配的正常组织相比,10个肿瘤样本中有9个显示SSRP1mRNA水平升高(图1B)。 (3)免疫组化实验 为了进一步研究SSRP1与大肠癌进展之间的关系,我们还测量了80例人类大肠癌组织样本及其配对正常组织中SSRP1的表达水平。SSRP1位于细胞质和细胞核中(图1D,E),这与先前报告的结果一致。 如图所示,SSRP1在大多数(85%,68/80)大肠癌标本中上调(图1F)。 这些数据清楚地表明SSRP1在大肠癌中的mRNA和蛋白质水平上调,这暗示了SSRP1在大肠癌发病机制中的重要性。 (4)SSRP1表达水平与疾病进展和患者生存期缩短相关 为了证实结直肠癌中SSRP1表达水平与临床病理因素之间的相关性,下载GSE14333的临床信息并进行统计分析。然后根据肿瘤组织中SSRP1的表达水平将数据集中的样本分为两组,并应用卡方检验。如表1所示,较高的SSRP1表达水平与Dukes期密切相关(P=0.003)。结果表明,SSRP1的高表达与肿瘤的快速扩散有关。重要的是,结果显示,SSRP1高表达肿瘤的大肠癌患者的DFS和RFS明显短于SSRP1低表达肿瘤的患者(图S1A,B)(分别为P=0.0025和P=0.019)。 这些发现强烈提示:SSRP1可能是大肠癌的一个新的预后因素。 二、细 胞 实 验 (1)siRNA干扰 为了验证SSRP1在结直肠癌细胞增殖中的生物学作用,我们使用三种siRNA在HCT116和SW480细胞中去除SSRP1。在将三个siRNA转染到CRC细胞后,我们使用Western blot分析来测量SSRP1蛋白水平。图S2A显示,与对照siRNA相比,所有靶向siRNA在两个细胞系中都能有效地敲除SSRP1;siRNA-2是最有效的。 (2)CCK8检测细胞增殖 正如所料,SW480(图S3A)和HCT116细胞(图2A)中的SSRP1 siRNA干扰显著抑制了细胞增殖,而HCT116细胞中的SSRP1过度表达增强了细胞增殖(图2A)。 (3)流式分析细胞周期 细胞增殖在很大程度上取决于细胞周期进程。因此,流式细胞术也评估了SSRP1基因敲除对细胞周期过程的影响。用si-SSRP1或对照siRNA处理48小时后,收集细胞并用PI染色。SSRP1基因敲除导致HCT116(图2D)和SW480细胞中G0/G1期细胞明显聚集,S/G2/M期细胞比例显著降低(图S3B);相反,SSRP1的过度表达促进了HCT116细胞的细胞周期进程(图2E)。 这些数据表明:SSRP1调节细胞周期。 (4)WB检测 p53是一种关键的细胞周期调节因子。如图2F所示,我们测定了SSRP1基因敲除后的p53表达水平,发现SSRP1基因敲除导致p53蛋白水平升高。我们进一步研究了几种p53下游细胞周期相关分子,发现在HCT116细胞中SSRP1基因敲除后,p21和p27表达上调。在SSRP1敲除细胞中,细胞周期蛋白D1和14-3-3(受p21负调控的细胞周期蛋白)的表达水平降低。此外,SSRP1的过度表达具有相反的效果。 这些结果表明SSRP1调节p53及其相关下游分子。SSRP1对p53通路的调控可能是SSRP1介导的大肠癌细胞周期进程的潜在机制。 (5)transwell分析 VEGF和MMP9是癌细胞侵袭和转移的关键蛋白,癌细胞自分泌这些细胞因子严重影响癌细胞的行为,例如侵袭。当SSRP1在HCT116细胞中被敲除时,MMP9和VEGF被下调(图3D),而在SSRP1过度表达的细胞中则出现相反的调节。 上皮-间充质转化(EMT)在癌症进展和转移中起着重要作用。鉴于SSRP1促进大肠癌细胞系的迁移和侵袭,我们接下来测试SSRP1是否影响大肠癌中的EMT过程。与我们的假设一致,在稳定的SSRP1过表达HCT116细胞中,上皮标记物 ZO-1和E-cadherin的蛋白表达水平明显降低;相反,间充质标记物Snail、Slug、ZEB1、ZEB2、N-钙粘蛋白和Twist的表达水平显著增加(图3D)。通过SSRP1基因敲除HCT116细胞获得了相应的结果(图3D)。 结果表明:SSRP1有助于促进结直肠癌细胞中EMT的表达,这至少部分解释了SSRP1过度表达促进结直肠癌细胞转移和侵袭的原因。 许多癌基因或肿瘤抑制基因在肿瘤发生过程中被解除调控,从而导致异常的细胞生物学特性,使癌细胞具有生长优势。糖酵解和线粒体生物发生的增加是癌症中最显著的代谢改变。ECAR是糖酵解的指标,OCR是线粒体呼吸的指标。因此,还评估了SSRP1对ECAR和OCR的影响。根据ECAR和OCR,与模拟处理和对照细胞相比,SSRP1过度表达的CRC细胞显示出更高的糖酵解率和更高的线粒体呼吸比率,而SSRP1敲除具有相反的效果(图S4A,B)。 这些数据表明:SSRP1通过促进CRC细胞的运动和增加糖酵解和有氧氧化促进恶性进展。 在探索SSRP1在结直肠癌细胞生长和转移中的作用后,我们试图确定SSRP1是否可用于临床结直肠癌治疗。化疗是治疗大肠癌的重要策略。然而,原发性和继发性耐药性是基础和临床研究中的一个重大挑战,在许多情况下,这大大降低了治疗的抗肿瘤效果。我们首先确定了SSRP1在顺铂治疗前后对细胞凋亡的影响。在这两种情况下,SSRP1基因敲除显著增加了凋亡SW480(图4A)和HCT116(图4B)细胞的数量。SSRP1对大肠癌细胞凋亡的负面影响促使我们假设SSRP1也可能与大肠癌细胞的耐药性有关。因此,我们在SSRP1敲除组和对照组中测定了两种细胞系对两种最常用化疗药物顺铂和5-氟尿嘧啶的化疗敏感性。结果显示,在SSRP1基因敲除的两个CRC细胞系组中,两种化疗药物的IC50值均显著降低(图4C)。 这些数据表明:SSRP1有益于降低结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性。 细胞凋亡与凋亡相关基因(包括Bcl-2)的调控密切相关。为了确定SSRP1调节细胞凋亡和化疗耐药的机制,通过Western blotting检测SSRP1敲除或稳定过度表达的HCT116细胞中凋亡相关蛋白的表达。如图S5所示,si-SSRP1转染诱导Bax(一种指示促凋亡表型的分子)的表达,并降低Bcl-2(一种指示抗凋亡表型的分子)的表达。相反,SSRP1过度表达对HCT116细胞有相反的影响。 结果表明:SSRP1通过促进细胞凋亡来促进结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性。 miRNAs在基因表达调控中起着重要作用。确认一种特定的miRNA是否能调节大肠癌中SSRP1的表达将是一件有趣的事情。预测了针对SSRP1 3UTR的潜在miRNA,并通过TargetScan、miRanda和miRwalk分析了其靶位点。为了减少假阳性,只有在三种方法都能预测的情况下,才会考虑候选人。通过这种方法确定的一个候选基因是miR-28-5p,它有一个位点与SSRP1的3UTR互补(图5A)。已经证实,在大肠癌中miR-28-5p下调;我们还通过分析GSE数据集验证了这一点(图5B)。 此外,miR-28-5p的过度表达抑制了CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。重要的是,Kaplan-Meier生存分析表明,具有低miR-28-5p表达水平的肿瘤的CRC患者的DFS时间明显短于具有高miR-28-5p表达的肿瘤的患者(图5C)(P=0.015)。因此,我们提出SSRP1的过度表达部分归因于miR-28-5p的下调。转染miR-28-5p后,我们观察到SW480和HCT116细胞中SSRP1蛋白水平降低(图5D)。我们发现miR-28-5p可以抑制HEK293T细胞中SSRP1的报告基因活性; 三、动 物 实 验 为了验证SSRP1在体内对大肠癌进展的影响,我们使用稳定转染SSRP1过表达慢病毒或对照慢病毒的HCT116细胞进行异种移植肿瘤检测。我们发现SSRP1的慢病毒表达导致异种移植肿瘤的加速生长(图2B,C)。这些数据共同证明SSRP1表达与CRC细胞增殖密切相关。 总结与思考 本文发现在大肠癌组织中SSRP1mRNA水平显著增加。还证实,这种上调与结直肠癌患者的晚期肿瘤阶段有关,SSRP1的高表达水平预示着更短的无病生存期和更快的复发。我们还发现SSRP1调节了大肠癌的增殖、转移、细胞能量代谢和上皮-间质转化。 此外SSRP1诱导的凋亡和SSRP1基因敲除增强了结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶和顺铂的敏感性。此外,我们还探讨了导致大肠癌中SSRP1失调的分子机制,并鉴定了 microRNA-28-5p(miR-28-5p)作为SSRP1的直接上游调节因子。我们得出结论,SSRP1促进CRC进展,并受到miR-28-5p调控。 文中涉及的试验技术 以上文献涉及的实验技术,均可在晶莱生物展开。 【晶莱生物】是一家专注于生物医学领域内科研学术服务的高新技术企业,致力于打造国内一流的生物技术服务品牌。为生物医学研究者提供动物造模、细胞生物学、基因组学、蛋白鉴定及分析、病理组化、表观遗传学等多个实验平台服务。
因此,选择该siRNA-2进行后续验证。SSRP1在HCT116细胞系中通过慢病毒介导的pLV-SSRP1质粒稳定过度表达,与其他CRC细胞系中的表达相比,HCT116细胞系中的SSRP1表达水平相对较低。SSRP1在细胞中的表达通过荧光显微镜、免疫印迹和qRT-PCR进行验证(图S2B-D)。